双Fc双特异性抗体的设计
设计一种包含两个Fc区域和两个不同抗原结合臂（Fab和VHH）的双Fc BsAb，并利用KiH技术促进异源二聚化。
通过共表达编码VHO、正常HC和LC-Fc融合的质粒，采用knob-into-hole突变和H435R突变，生成双Fc BsAb。
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一种具有增强Fc效应功能的新型双Fc双特异性抗体
A Novel Dual-Fc Bispecific Antibody with Enhanced Fc Effector Function.
实验完整度
高包含分子构建、表达纯化、生化表征（BLI、热稳定性）、细胞结合（流式）、功能活性（报告基因ADCC/ADCP、PBMC ADCC）及PK多个独立证据层级，并进行机制验证。
主要模型
Expi293F细胞表达系统 H292细胞系 MKN45细胞系 BALB/c-nu裸鼠
重点核对
双Fc BsAb的构建：共转染比例（HC:VHO HC:LC-Fc = 1:1:3） 靶细胞选择：H292（EGFR高、cMet低）和MKN45（EGFR低、cMet高） 效应细胞：Jurkat-FcγRIIIa-V158和Jurkat-FcγRIIa-H131，E:T比例为5:1 PBMC ADCC测定：E:T比例为25:1 PK实验：BALB/c-nu裸鼠，腹腔注射10 mg/kg，采血时间点分组
摘要
双特异性抗体（BsAbs）正在持续开发用于肿瘤和自身免疫性疾病的应用。虽然通过拥有多个靶向臂可以增加活性，但大多数BsAb工程采用单克隆抗体的单一Fc结合。在这里，我们设计了一种新型的源自免疫球蛋白γ-1（IgG1）的双Fc BsAb，包含两个Fc区域和两个不同的不对称抗原结合臂，分别由Fab臂和另一个VHH结构域组成。结合knob-into-hole技术，双Fc BsAbs可以高产量和良好的稳定性生产。我们探索了Fc工程对双Fc构建体的影响如何增强所需的治疗效果。这种新型格式能够同时与相应抗原进行双特异性结合。此外，与单Fc对照分子相比，双Fc BsAbs通过有效的亲和力，通过同时结合两个抗原和Fc受体，显示出增强的基于亲合力的FcγR结合，从而导致更高的ADCC和ADCP活性。总体而言，这种具有增强效应功能的新型BsAb格式为基于抗体的免疫治疗提供了新的选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在开发一种新型IgG1来源的双Fc双特异性抗体格式，包含两个Fc区域和两个不同的抗原结合臂，并评估其增强Fc效应功能的潜力。
- 核心机制
- 双Fc结构通过两个Fc区域与FcγRs的亲和力结合，增强了ADCC和ADCP活性；同时，双靶向的亲和力效应可进一步增强生物活性。
- 主要证据
- BLI实验显示双Fc BsAb与FcγRs的亲和力增强（KD降低32-259倍）；报告基因实验显示ADCC EC50降低10-45倍、ADCP EC50降低90-687倍；PBMC ADCC实验显示ADCC活性增强。
- 研究意义
- 这种新型双Fc BsAb格式为基于抗体的免疫治疗提供了新的选择，具有增强的效应功能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白表达和纯化
验证双Fc BsAb的可生产性，并比较其与单Fc BsAb的产量和纯度。
在Expi293F细胞中共表达各类抗体，通过Protein A和SEC纯化，分析产量和纯度。
生化表征：热稳定性和结合动力学
评估双Fc BsAb的热稳定性，并通过BLI检测其与抗原和Fc受体的结合动力学。
使用热位移实验测量Tm值；使用BLI测量抗体与EGFR/cMet和FcγR的结合亲和力及同时结合能力。
细胞结合分析
验证双Fc BsAb与肿瘤细胞的结合能力。
通过流式细胞术检测抗体与H292和MKN45细胞的结合。
ADCC和ADCP报告基因生物测定
评估双Fc BsAb诱导ADCC和ADCP的活性。
使用Jurkat-FcγRIIIa-V158和Jurkat-FcγRIIa-H131效应细胞，以H292或MKN45为靶细胞，测量NFAT激活。
PBMC基础ADCC分析
在更生理的条件下评估双Fc BsAb的ADCC活性。
使用人PBMC作为效应细胞，以H292或MKN45为靶细胞，通过LDH释放检测细胞毒性。
药代动力学研究
评估双Fc BsAb在体内的药代动力学特征，特别是半衰期。
在BALB/c-nu裸鼠中进行PK研究，给药10 mg/kg，采血并通过ELISA检测血药浓度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Expi293F细胞 | Gibco | A14527 |
| Expi293表达培养基 | Gibco | A1435101 | |
| H292细胞 | National Collection of Authenticated Cell Cultures of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-582 | |
| MKN45细胞 | Nanjing Cobioer Bioscience | CBP60488 | |
| RPMI-1640培养基 | Corning | 10-040-CVRC | |
| 胎牛血清 | Sigma | F8318 | |
| 转染 | Expifectamine293转染试剂盒 | Gibco | A14527 |
| 蛋白纯化 | MabSelect SuRe柱 | Cytiva | 11003494 |
| ÄKTA pure 25系统 | Cytiva | 29018224 | |
| 柠檬酸钠 | made in house | -- | |
| 1 M Tris-HCl溶液，pH 9.0 | Sangon Biotech | 8548128 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL 24 mL柱 | Cytiva | 28990944 | |
| 蛋白表征 | 预铸SurePAGE 4-12% Bis-Tris凝胶 | GenScript | M00654 |
| 考马斯亮蓝 | made in house | -- | |
| Agilent 1260 Infinity II液相色谱系统 | Agilent Technologies | G7167A | |
| AdvanceBio SEC柱 | Agilent Technologies | PL1180-5301 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma | 104873 | |
| 热稳定性试验 | LightCycler 480实时PCR仪 | Roche | 05015278001 |
| SYPRO Orange染料 | Thermo Fisher Scientific | S6650 | |
| 96孔RT-PCR板 | Monad Biotech | MQ50301S | |
| 光学透明粘性膜 | Monad Biotech | MQ65001M | |
| BLI | Octet QKe仪器 | Sartorius | FB-40601 |
| 抗人Fc 2 (AHC2)生物传感器 | Sartorius | 18-5142 | |
| 人EGFR | KACTUS | EGF-HM401B | |
| cMet抗原 | KACTUS | MET-HM401B | |
| 生物素化人FcγRI (CD64) | Sino Biological | 10256-H08S-B | |
| FcγRIIa (CD32a) | Sino Biological | 10374-H27H1-B | |
| FcγRIIIa V158等位基因(CD16a) | ACRO Biosystems | CDA-H82E9 | |
| SA生物传感器 | Sartorius | -- | |
| 人FcRn | Sino Biological | CT009-H08H | |
| 流式细胞术 | CYTOFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| CytExpert 2.4.0.28软件 | -- | -- | |
| 无酶细胞解离缓冲液 | Gibco | WHO621 | |
| Alexa Fluor 647标记亲和纯化山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性检测抗体 | Jackson ImmunoResearch | 109-605-190 | |
| ADCC/ADCP报告基因 | Jurkat-FcγRIIIa-V158效应细胞 | Vazyme | DD1301-01 |
| Jurkat-FcγRIIa-H131效应细胞 | Vazyme | DD1304-01 | |
| 96孔白色平底板 | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
| Bio-Lite荧光素酶检测底物 | Vazyme | DD1201-01 | |
| 多功能酶标仪 | Tecan | -- | |
| PBMC ADCC | 不含酚红的RMPI-1640 | BOSTER | PYG0035 |
| 人PBMC细胞 | SAILYBIO | SC12282W | |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| LDH检测试剂盒 | Roche | 11644793001 | |
| PK | BALB/c-nu裸鼠 | -- | -- |
| 人IgG预包被酶联免疫吸附测定试剂盒 | Dakewe | 1128162 | |
| HRP标记山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性多克隆抗体 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| TMB底物溶液 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 终止液 | Solorbio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 双Fc BsAb的构建与表达 | 共转染比例（HC:VHO HC:LC-Fc = 1:1:3）；使用Expi293F细胞，密度2×10^6 cells/mL；转染后6天收获 阅读提示：Materials and Methods, Constructs, Expression, and Purification |
| BLI结合分析 | 传感器类型（AHC2用于抗体固定，SA用于FcγR固定）；抗原浓度范围（100-1.6 nM）；FcγR浓度范围（400-100 nM）；结合与解离时间 阅读提示：Materials and Methods, Biolayer Interferometry以及图2、3的图注 |
| 热稳定性实验 | 蛋白浓度（0.2 mg/mL），染料稀释倍数（4×），升温速率（1 °C/min），测试缓冲液（PBS） 阅读提示：Materials and Methods, Thermal Shift Assay |
| 细胞结合分析 | 细胞系（H292，MKN45），抗体浓度（从50 nM起3倍稀释），孵育时间（1小时，冰上），检测抗体浓度（1:5000） 阅读提示：Materials and Methods, Flow Cytometry |
| ADCC和ADCP报告基因测定 | 效应细胞（Jurkat-FcγRIIIa-V158或Jurkat-FcγRIIa-H131），靶细胞（H292或MKN45），E:T比例5:1，抗体浓度（从66.7 nM起3倍稀释），孵育时间6小时 阅读提示：Materials and Methods, ADCC and ADCP Reporter Bioassays |
| PBMC ADCC测定 | 效应细胞（人PBMC），靶细胞（H292或MKN45），E:T比例25:1，抗体浓度（从50 nM起3倍稀释），孵育时间6小时，LDH检测 阅读提示：Materials and Methods, PBMC-Based ADCC |
| 药代动力学研究 | 小鼠品系（BALB/c-nu），给药剂量（10 mg/kg），给药途径（腹腔注射），采血时间点（0.5h、1、3、7、10、21天或1h、2、5、14、28天） 阅读提示：Materials and Methods, Pharmacokinetics |