GPR34表达特异性鉴定
鉴定能够区分ILC1s和cNK细胞的表面标志物。
利用单细胞RNA测序分析多种组织中的ILC1s和cNK细胞，并通过构建tdTomato-GPR34和HA-GPR34报告小鼠，通过流式细胞术验证GPR34在不同免疫细胞上的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
GPR34是ILC1介导的抗肿瘤免疫的代谢免疫检查点
GPR34 is a metabolic immune checkpoint for ILC1-mediated antitumor immunity
实验完整度
高包含体外细胞实验、多种小鼠肿瘤模型（皮下、肝转移）、基因敲除/条件敲除、药理学拮抗剂、流式细胞术、RNA-seq及临床样本分析，具备多层次功能验证和机制验证。
主要模型
MC38结肠癌细胞皮下及肝转移模型 B16F10黑色素瘤皮下模型 LLC肺癌皮下模型 小鼠肝ILC1体外培养
重点核对
Gpr34在ILC1上的特异性表达（流式、单细胞RNA-seq） LysoPS在肿瘤微环境中的浓度（LC-MS） GPR34缺失或拮抗对肿瘤生长的影响（皮下及肝转移模型） LysoPS通过cAMP-PKA-CREB通路抑制ILC1功能（体外抑制实验） ABHD16A缺失对LysoPS产生和肿瘤生长的影响（CRISPR敲除）
摘要
1型固有淋巴细胞（ILC1s）是一类具有抗肿瘤活性的组织驻留细胞，提示其在实体瘤免疫监视中可能发挥作用，但尚不清楚操纵ILC1s能否诱导强效的抗肿瘤免疫应答。在此，我们发现G蛋白偶联受体34（GPR34），一种溶血磷脂酰丝氨酸（LysoPS）的受体，在肿瘤微环境中的ILC1s上高表达，但在传统自然杀伤（cNK）细胞上不表达。LysoPS在肿瘤微环境中富集，并可通过GPR34抑制ILC1活化。在肿瘤中基因敲除LysoPS合酶Abhd16a的表达，或在ILC1s中敲除Gpr34的表达，或拮抗GPR34，均可增强ILC1的抗肿瘤活性。在癌症患者中，肿瘤中ABHD16A的表达或ILC1s中GPR34的表达与ILC1s或ILC1样细胞的抗肿瘤活性呈负相关。因此，我们的结果表明，操纵ILC1s可以诱导强效的抗肿瘤免疫，GPR34是一个可靶向的代谢免疫检查点，可用于开发基于ILC1的免疫疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 操纵ILC1s能否诱导强效抗肿瘤免疫，以及GPR34在其中的作用机制。
- 核心机制
- 肿瘤微环境中富集的LysoPS通过GPR34激活cAMP-PKA-CREB通路，抑制ILC1的增殖和细胞毒性功能，从而促进肿瘤生长。
- 主要证据
- GPR34在ILC1s上高表达，肿瘤中LysoPS浓度升高，Gpr34缺失或拮抗剂增强ILC1抗肿瘤活性并抑制肿瘤生长，ABHD16A缺失降低LysoPS并抑制肿瘤，机制涉及cAMP-PKA-CREB通路，人肿瘤样本中GPR34/ABHD16A表达与ILC1活性负相关。
- 研究意义
- 该研究证明操纵ILC1s可诱导强效抗肿瘤免疫，GPR34作为代谢免疫检查点，是开发基于ILC1的免疫疗法（尤其是对于ILC1富集的器官如肝脏中的实体瘤）的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
GPR34对肿瘤生长的影响
验证GPR34是否调控ILC1介导的抗肿瘤免疫。
使用Gpr34全敲除小鼠（Gpr34-/-）、条件性敲除小鼠（Gpr34fl/flNcr1Cre等）及抗NK1.1抗体耗竭实验，分析MC38、LLC、B16F10皮下肿瘤和肝转移模型中的肿瘤生长，并评估ILC1数量、增殖和功能分子（IFNγ、颗粒酶、穿孔素）。
LysoPS对ILC1功能的体外抑制验证
测试LysoPS是否直接抑制ILC1活化，并验证其是否通过GPR34和cAMP-PKA-CREB通路起作用。
分选肝ILC1s，用不同浓度LysoPS预处理，并用IL-12/IL-15/IL-18刺激，检测IFNγ、穿孔素、颗粒酶C/B的表达；使用AC、PKA、CREB抑制剂及Gpr34基因敲除验证信号通路。
肿瘤细胞来源的LysoPS验证
确认肿瘤细胞产生的LysoPS通过GPR34抑制ILC1抗肿瘤活性。
使用CRISPR-Cas9在肿瘤细胞中敲除ABHD16A，检测LysoPS产生、肿瘤生长、ILC1数量和功能，并在Gpr34-/-小鼠中验证依赖性。
GPR34拮抗剂的抗肿瘤效果评估
测试药理学拮抗GPR34是否增强ILC1抗肿瘤活性并抑制肿瘤生长，以及与抗TIGIT联合的效果。
使用GPR34拮抗剂（T8848）处理荷瘤小鼠，监测肿瘤生长；分析ILC1浸润和功能；并与抗TIGIT联合治疗。
临床相关性分析
评估LysoPS-GPR34轴在人类癌症中的临床意义。
分析人结肠癌、头颈癌、肝癌肿瘤组织中GPR34表达与ILC1活性的关联，使用公共单细胞RNA-seq数据（COAD和黑色素瘤）及TCGA/GEO生存数据。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | BI | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Biological Industries (BI) | -- | |
| 基因编辑 | lentiCRISPR v2载体 | Addgene | 52961 |
| Esp3I限制酶 | New England Biolabs | -- | |
| 细胞处理 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 流式细胞术 | 活力染料620 | BD Biosciences | 564996 |
| 可固定活力染料eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| FACSAria Fusion流式细胞分选仪 | BD | -- | |
| LSRFortessa流式细胞分析仪 | BD | -- | |
| 固定/破膜缓冲液 | -- | -- | |
| 细胞刺激 | 佛波醇酯 | Sigma-Aldrich | 79346 |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | 407952 | |
| 莫能菌素 | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| 白细胞介素-12 | Sino Biological | 51004-MCCH | |
| 白细胞介素-15 | Peprotech | 210-15 | |
| 白细胞介素-18 | Sino Biological | 50073-NNCE | |
| 信号通路抑制 | SQ22536 | Selleckchem | S8283 |
| Barbadin | MCE | HY-119706 | |
| CCG-1423 | Selleckchem | S7719 | |
| FTS（法尼基硫代水杨酸） | Cayman | 162520-00-5 | |
| U73122 | TargetMol | T6243 | |
| 毛喉素 | MCE | HY-15371 | |
| H-89 | MCE | HY-15979A | |
| 666-15 | MCE | HY-101120 | |
| 信号通路研究 | 溶血磷脂酰丝氨酸（17:1） | Avanti | 858141 |
| 药物处理 | GPR34拮抗剂 | Shanghai Topscience Biological Technology | 907952-06-1 |
| 抗体治疗 | 抗TIGIT抗体 | Bio X Cell | BP0274 |
| 细胞耗竭 | 抗NK1.1抗体 | Bio X Cell | BP0036 |
| 蛋白质印迹 | 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 60008-1-Ig |
| 抗ABHD16A抗体 | Abcam | ab185549 | |
| 抗CREB抗体 | CST | 4820 | |
| 抗磷酸化CREB (Ser133)抗体 | CST | 9198 | |
| 抗磷酸化PKA底物抗体 | CST | 9624 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| RT-qPCR | HiScript III反转录预混液（去除基因组DNA） | Vazyme | R323 |
| SYBR Green预混液 | Takara Bio | -- | |
| LightCycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5138 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| 淋巴细胞分离 | Percoll分离液 | -- | -- |
| 组织消化 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C0130 |
| D型胶原酶 | Sigma-Aldrich | 11088866001 | |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | Biosharp | BL503A |
| LC-MS分析 | Vanquish Flex超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive四极杆-轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Gemini 5U C18色谱柱 | Phenomenex | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GPR34表达分析 | 小鼠品系（tdTomato-GPR34报告小鼠） 阅读提示：Methods: Animals; Results: Fig. 1c,d |
| 肿瘤模型 | 细胞系（MC38, LLC, B16F10），接种数量（1×10^6, 1×10^6, 5×10^5），接种方式（皮下或脾内），小鼠品系（Gpr34fl/flNcr1Cre等） 阅读提示：Methods: Tumor transplantation and in vivo treatments; Results: Fig. 2c-h,i-l |
| 体外LysoPS抑制实验 | 肝ILC1分选纯度（>98%），LysoPS浓度（1,5 μM），刺激细胞因子浓度（IL-12 20ng/ml, IL-15 50ng/ml, IL-18 100ng/ml），刺激时间（12h），预处理时间（1h） 阅读提示：Methods: In vitro culture and stimulation of ILC1s and cNK cells; Results: Fig. 3b-e |
| GPR34拮抗剂治疗 | GPR34拮抗剂剂量（具体数值见文献），给药方式（腹腔注射每日一次），治疗起始时间（肿瘤体积30-80mm3） 阅读提示：Methods: Tumor transplantation and in vivo treatments; Results: Fig. 5a-c, Extended Data Fig. 9a-c |
| 信号通路分析 | 抑制剂浓度（SQ22536 20μM, H-89 10μM, 666-15 0.5μM），LysoPS刺激时间（15min） 阅读提示：Methods: In vitro culture and stimulation of ILC1s and cNK cells; Results: Fig. 3f-i, Extended Data Fig. 7c |