单细胞转录组分析鉴定mpSSC群
鉴定干骺端区域可能的骨骼干细胞群体及其转录特征。
对P7.5 Col10a1-ZsGreen小鼠的胫骨和股骨进行scRNA-seq，分析5861个骨骼细胞，通过UMAP聚类和标记基因鉴定出14个细胞簇，其中簇1为mpSSC，标记为Sstr2+或Pdgfrb+Kitl−。
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鉴定构建骨小梁的干骺端骨骼干细胞
Identification of the metaphyseal skeletal stem cell building trabecular bone.
实验完整度
高包含单细胞转录组、遗传谱系追踪、克隆分析、体外多向分化、肾囊移植和骨损伤移植功能验证，以及Hgs敲除的功能和机制验证。
主要模型
Col10a1-ZsGreen小鼠 Col10a1tdTomato;KitlGFP小鼠 CPYT小鼠 Col10a1-Cre;Hgsfl/fl小鼠
重点核对
mpSSC标记为Sstr2+或Pdgfrb+Kitl− HC特异性Hgs缺失 PdgfrbLSL-Dre谱系追踪系统 肾囊移植和骨损伤移植模型 confetti clonal tracing
摘要
能够自我更新和多向分化的骨骼干细胞（SSCs）参与骨发育和稳态。已报道了不同骨骼部位的多个SSC群体。在这里，我们鉴定了一个干骺端SSC（mpSSC）群体，其转录景观不同于其他骨间充质基质细胞（BMSCs）。这些mpSSCs以Sstr2或Pdgfrb+Kitl−为标记，位于生长板正下方，并完全来源于肥大软骨细胞（HCs）。这些HC来源的mpSSCs在体外和体内具有自我更新和多能性，出生后产生大部分HC后代。HC特异性的Hgs缺失，Hgs是内体分选复合物所需转运的一个组分，会损害HC向mpSSC的转化并损害骨小梁形成。因此，mpSSC是骨髓中BMSCs和成骨细胞的主要来源，支持出生后骨小梁的形成。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 骨髓中是否存在具有特定标记、时空特征和细胞来源的新的骨骼干细胞群体？
- 核心机制
- HCs通过去分化直接转化为Sstr2+或Pdgfrb+Kitl−的mpSSCs，这些mpSSCs作为主要来源产生骨髓中的BMSCs和成骨细胞，支持出生后骨小梁形成。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序鉴定出mpSSC群，遗传谱系追踪显示其来源于HCs，肾囊移植和骨损伤移植证明其自我更新和多向分化能力，Hgs缺失损害HC向mpSSC转化并减少骨小梁形成。
- 研究意义
- 揭示了mpSSC作为出生后骨小梁形成的主要细胞来源，为骨骼干细胞生物学提供新见解，并可能对骨骼再生和疾病治疗具有意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
遗传谱系追踪验证mpSSC的HC来源
验证mpSSC是否来源于肥大软骨细胞。
使用Col10a1-Cre;ROSA26LSL-ZsGreen、Col10a1-Cre;ROSA26LSL-tdTomato;KitlGFP、Ihh-Dre和Col2a1-CreERT;ROSA26nTnG或Acan-CreERT2;ROSA26LSL-nTnG小鼠进行谱系追踪，结合IF染色和克隆分析，证明mpSSC直接来源于HCs。
体内功能验证mpSSC的干性
验证mpSSC是否具有自我更新和多向分化能力。
使用Ihh-Dre;Sstr2-CreERT2;ROSA26Confetti2进行克隆追踪，Ihh-Dre;Sstr2-CreXER;ROSA26LSL-EYFP/RSR-tdTomato小鼠检查多能性，结合免疫荧光检测Sstr2+细胞及其后代的分化。
体外和移植模型验证mpSSC功能
评估mpSSC的克隆形成、自我更新和多向分化能力。
通过CFU-F实验、连续克隆形成和多向分化实验，以及肾囊移植和骨损伤移植实验，验证mpSSC的干性。
检测mpSSC对HC后代的贡献
确定mpSSC是否产生大部分HC后代。
使用CPYT小鼠在不同时间点（P1, P7, P15, P30, P180, P480）对HC后代进行定量和定位，通过IF染色和细胞计数分析。
Hgs基因缺失功能研究
验证Hgs在HC向mpSSC转化和骨小梁形成中的作用。
通过敲除HC中的Hgs基因，检测mpSSC数量、BMSCs和OLCs数量，以及骨小梁参数（微CT），评估对骨形成的影响。
肾囊移植验证Hgs缺失对HC转化的影响
进一步验证Hgs缺失对HC向mpSSC转化的影响。
将Hgs敲除小鼠的肥大软骨移植到肾囊，检测其转化为BMSCs的能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因功能分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞制备 | I型胶原酶 | Gibco | 17100017 |
| II型胶原酶 | Gibco | 17100015 | |
| 单细胞测序 | Chromium单细胞3'试剂盒v3 | 10x Genomics | -- |
| NovaSeq平台 | Illumina | -- | |
| 流式分选 | FACSAria III | BD Bioscience | -- |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | 11885084 |
| 胎牛血清 | Gibco | 12664025 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240-062 | |
| 移植实验 | 基质胶 | Corning | 356234 |
| 免疫荧光 | GFP抗体 | CST | 2956 |
| RFP抗体 | Rockland | 600-401-379 | |
| Pdgfrb抗体 | CST | 3169 | |
| Sstr2抗体 | Abcam | ab134152 | |
| N-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab76011 | |
| Pdpn抗体 | Sino Biological | 50256-R066 | |
| CD200抗体 | Novusbio | BAF3355 | |
| CD51抗体 | Abcam | ab208012 | |
| Ly51抗体 | Sino Biological | 50082-T24 | |
| Thy1抗体 | Sino Biological | 50461-T44 | |
| CD105抗体 | Abcam | ab221675 | |
| Ki67抗体 | CST | 12202 | |
| Lepr抗体 | Novusbio | BAF497 | |
| Hgs抗体 | Abcam | ab155539 | |
| Sox9抗体 | Abcam | ab185966 | |
| CD31抗体 | CST | 77699 | |
| CD45抗体 | CST | 70257 | |
| Ter119抗体 | BioLegend | 116201 | |
| Emcn抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-5851-82 | |
| 流式分析 | CD45抗体 | BioLegend | 103154 |
| CD31抗体 | BioLegend | 102528 | |
| Ter119抗体 | BioLegend | 116223 | |
| CD140b（Pdgfrb）抗体 | BioLegend | 136010 | |
| 单细胞测序 | EasySep小鼠链霉亲和素RapidSpheres分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19860 |
| 生物素抗小鼠CD31抗体 | BioLegend | 102503 | |
| 生物素抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103104 | |
| 生物素抗小鼠TER-119抗体 | BioLegend | 116203 | |
| 死细胞去除试剂盒 | STEMCELL Technologies | 130090101 | |
| 3D成像 | Imaris | Bitplane AG | -- |
| 图像分析 | HALO | Indica Labs | -- |
| 显微镜 | LSM880 | Zeiss | -- |
| 细胞培养 | ECLIPSE Ti-U倒置显微镜 | Nikon | -- |
| 多向分化 | 分化试剂盒 | STEMCELL Technologies | 05507, |
| 组织学 | Triton X-100 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA测序 | 小鼠年龄：P7.5；组织：后肢骨；细胞分选：CD31−CD45−Ter119−；测序平台和试剂盒版本 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Cell preparation for scRNA-seq' 和 'Processing and analysis of scRNA-seq data' |
| 谱系追踪 | 小鼠品系：Col10a1-Cre;ROSA26LSL-ZsGreen, Col10a1-Cre;ROSA26LSL-tdTomato;KitlGFP, Ihh-Dre, Col2a1-CreERT, Acan-CreERT2；他莫昔芬剂量和给药时间 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Lineage tracing performed on inducible mouse models' |
| CFU-F实验 | 小鼠年龄：P30；细胞密度：2×10^5细胞/10cm皿；培养条件：低氧，37°C，2周 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Marrow stromal cell isolation, successional clonal formation, and multilineage differentiation' |
| 肾囊移植 | 细胞数：6000-10000；Matrigel体积：2-3 μl；受体：6-8周龄NOD SCID小鼠；分析时间：4周 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Cell isolation, FACS, and renal capsule transplantation' |
| 骨损伤移植 | 细胞数：6000-10000；注射位置：胫骨内侧干骺端孔；分析时间：10-14天 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Bone injury and transplantation' |
| 微CT分析 | 扫描参数：电压80kV，电流500mA，分辨率9.2 μm/pixel；分析区域：生长板下0.5-2.3mm 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Micro-CT analysis' |
| 免疫荧光 | 抗体列表、稀释比例、TSA荧光团、抗原修复条件 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Multiplex IF assay' |