分离S2特异性单克隆抗体
从SARS-CoV-2恢复期个体中分离靶向S2亚基的单克隆抗体。
通过单细胞分选从PBMCs中分离记忆B细胞，使用WH-1 S2蛋白或Delta刺突三聚体作为诱饵，随后重建抗体并通过ELISA筛选S2特异性结合。
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刺突蛋白S2亚基编码SARS-CoV-2功能性抗体反应的多种靶点
The S2 subunit of spike encodes diverse targets for functional antibody responses to SARS-CoV-2.
实验完整度
高研究包含两个独立证据层级：体外模型（细胞系、假病毒）和患者样本（PBMCs、血浆），并进行功能验证（中和、ADCC）和机制验证（表位定位、竞争ELISA），符合高水平标准。
主要模型
HEK293T-ACE2细胞 CEM.NKr.Spike细胞 SARS-CoV-2恢复期个体PBMCs
重点核对
单克隆抗体来源：两名恢复期个体（C20和C68）的PBMCs，采集时间为症状出现后30天 中和实验使用假病毒和HEK293T-ACE2靶细胞，筛选浓度10 μg/mL，剂量反应曲线起始浓度20-80 μg/mL ADCC实验使用原代PBMCs（两个供体）和表达刺突的CEM.NKr.Spike靶细胞，效应细胞与靶细胞比例10:1，抗体浓度5 μg/mL，孵育4小时 竞争ELISA使用WH-1刺突三聚体（1 μg/mL）和S2蛋白（昆虫细胞来源）作为抗原，阻断抗体浓度分别为2.5 μg/mL和25 μg/mL 表位定位使用PhIP-seq，Phage-DMS库（31 aa肽，30 aa重叠）和pan-CoV库（39 aa肽，19 aa重叠）
摘要
导致COVID-19全球大流行的SARS-CoV-2病毒表现出惊人的进化能力，持续逃避疫苗和感染诱导的免疫反应。刺突糖蛋白S1亚基受体结合域的突变导致抗体反应显著逃逸，降低了疫苗和单克隆抗体（mAb）疗法的效力。因此，有必要研究刺突蛋白更保守的区域，如S2亚结构域。在此，我们展示了来自两名SARS-CoV-2恢复期个体的S2单克隆抗体集合，这些抗体靶向S2中的多个区域，包括常见报道区域之外的区域。其中一种S2单克隆抗体C20.119，结合融合肽中一个高度保守的表位，能够广谱中和SARS-CoV-2变异株、SARS-CoV-1以及相关的动物源性沙贝病毒。大多数单克隆抗体不具有中和活性；然而，其中许多可以介导抗体依赖性细胞毒性（ADCC），水平与先前授权用于治疗SARS-CoV-2感染的S1靶向抗体S309相当。几种具有ADCC功能的单克隆抗体也结合其他人类冠状病毒（HCoV）的刺突三聚体，如MERS-CoV和HCoV-HKU1。我们的发现表明，S2单克隆抗体可以靶向S2中的多种表位，包括具有HCoV和沙贝病毒广谱性的功能性抗体，这些抗体可能靶向刺突蛋白功能受限的区域。这些单克隆抗体可用于应对潜在的未来大流行，同时也为引发广泛的HCoV反应提供了理想表位的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- S2亚基是否包含可被功能性抗体靶向的保守表位，这些抗体能否提供超越S1靶向抗体的广谱保护？
- 核心机制
- S2单克隆抗体通过结合保守表位（如融合肽和S2'切割位点）介导中和活性，或通过Fc效应功能（ADCC）发挥作用，从而提供针对SARS-CoV-2变异株和HCoV的交叉反应性。
- 主要证据
- 从恢复期个体中分离的40个S2单克隆抗体，通过ELISA、假病毒中和实验、ADCC实验和PhIP-seq表位定位，发现C20.119靶向融合肽并广谱中和，多种抗体介导ADCC并与S309相当。
- 研究意义
- S2靶向抗体可能为设计更广泛的冠状病毒疫苗提供靶点，并可用于应对未来潜在的大流行。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
表征S2单克隆抗体的结合广度
评估S2单克隆抗体对SARS-CoV-2变异株和HCoV的结合广度。
通过ELISA检测抗体对多种刺突三聚体和S2蛋白的结合，包括不同VOC和HCoV。
评估中和活性
确定S2单克隆抗体是否具有中和SARS-CoV-2及沙贝病毒的能力。
使用假病毒中和实验，筛选所有抗体的中和能力，并对C20.119进行剂量反应曲线测定。
评估ADCC功能
确定S2单克隆抗体是否介导非中和性Fc效应功能。
通过流式细胞术检测NK细胞活化（CD107a和IFN-γ）和靶细胞死亡，评估抗体的ADCC活性。
定义表位竞争组
通过竞争ELISA确定S2单克隆抗体共享的表位区域。
使用WH-1刺突三聚体或S2蛋白作为抗原，与已知表位的参考抗体进行竞争ELISA，并通过聚类分析分组。
线性表位定位
鉴定S2单克隆抗体的线性表位。
使用PhIP-seq技术，用两个噬菌体展示肽库（Phage-DMS和pan-CoV）筛选抗体的结合肽段，并通过深度突变扫描确定关键结合残基。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞分选 | CD3-BV711抗体 | BD Biosciences | -- |
| CD14-BV711抗体 | BD Biosciences | -- | |
| CD16-BV711抗体 | BD Biosciences | -- | |
| CD19-BV510抗体 | BD Biosciences | -- | |
| IgM-FITC抗体 | BD Biosciences | -- | |
| IgD-FITC抗体 | BD Biosciences | -- | |
| WH-1刺突S2蛋白 | Acro Biosystems | S2N-C52E8 | |
| 重组抗体表达 | FreeStyle 293-F细胞 | Invitrogen | -- |
| ELISA | SARS-CoV-2 WH-1刺突三聚体 | Sino Biological | 40589-V08H4 |
| Delta刺突三聚体 | Sino Biological | 40589-V08H10 | |
| Omicron BA.1刺突三聚体 | Sino Biological | 40589-V08H26 | |
| Omicron BA.2刺突三聚体 | Sino Biological | 40589-V08H28 | |
| Omicron BA.4/BA.5刺突三聚体 | Sino Biological | 40589-V08H32 | |
| Omicron XBB刺突三聚体 | Sino Biological | 40589-V08H40 | |
| Omicron BQ.1.1刺突三聚体 | Sino Biological | 40589-V08H41 | |
| SARS-CoV-1刺突三聚体 | Acro Biosystems | SPN-S52Ht | |
| HCoV-HKU1刺突三聚体 | Acro Biosystems | SPN-H52H5 | |
| SARS-CoV-2 S1蛋白 | Sino Biological | 40591-V08H | |
| SARS-CoV-2 S2蛋白（昆虫细胞来源） | Sino Biological | 40590-V08B | |
| SARS-CoV-2 S2蛋白（哺乳动物细胞来源） | Sino Biological | 40590-V08H1 | |
| 流式细胞术 | 抗人IgG Fcγ片段特异性PE | Jackson Immuno | 109-115-098 |
| ADCC实验 | 抗CD107a APC抗体 | BioLegend | -- |
| 抗CD56 BV605抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗IFNγ-PE抗体 | BioLegend | -- | |
| 可固定活力染料eFluor 780 | eBioscience | -- | |
| IC固定/透化液 | Invitrogen | -- | |
| PhIP-seq | 蛋白A和蛋白G磁珠 | Invitrogen | -- |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| Quant-iT PicoGreen染料 | Thermo Fisher | -- | |
| 测序 | Illumina MiSeq测序仪 | Illumina | -- |
| 流式细胞术 | Fortessa LSRII流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 分离S2特异性B细胞 | PBMCs采集时间（症状出现后30天），诱饵蛋白（WH-1 S2蛋白和Delta刺突三聚体） 阅读提示：Materials and methods: Single-cell sorting for spike-specific memory B cells |
| 结合ELISA | 抗体浓度（1 μg/mL），S2蛋白来源（昆虫或哺乳动物细胞），刺突三聚体种类和浓度 阅读提示：Materials and methods: Binding determined by direct enzyme-linked immunosorbent assays |
| 假病毒中和实验 | 靶细胞（HEK293T-ACE2），抗体浓度（筛选10 μg/mL，C20.119稀释曲线起始浓度），假病毒批次 阅读提示：Materials and methods: Spike-pseudotyped lentivirus neutralization |
| ADCC实验 | 效应细胞（PBMCs）供体，靶细胞（CEM.NKr.Spike），效应细胞与靶细胞比例（10:1），抗体浓度（5 μg/mL），孵育时间（4小时） 阅读提示：Materials and methods: SARS-CoV-2 Spike ADCC assay to detect activated NK cells |
| 竞争ELISA | 抗原（WH-1刺突三聚体或S2蛋白），阻断抗体浓度，生物素化抗体浓度，抗体对浓度 阅读提示：Materials and methods: Epitope groups defined by competition ELISAs |
| PhIP-seq | 肽库类型（Phage-DMS或pan-CoV），抗体浓度（10 ng/well），mAb或血浆用量 阅读提示：Materials and methods: Phage-display immunoprecipitation and deep sequencing |