构建血管化口腔黏膜等效物（VOME）
建立体外三维细胞重建的口腔黏膜等效物模型。
将HGECs、HGFs和VELCs按顺序种植于ACVM-0.25% HLC-I支架上，共培养形成复合体，并植入裸鼠体内进行动态强化。
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基于血管稳态表型修饰的三维细胞重建口腔黏膜等效物的血管化特征与功能再生
Vascularized characteristics and functional regeneration of three-dimensional cell reconstruction of oral mucosa equivalents based on vascular homeostasis phenotypic modification.
实验完整度
高包含体外细胞模型（VELCs管形成实验）、体内动物模型（裸鼠皮下植入）及多种检测手段（免疫荧光、SEM、生物力学、超声），并进行功能验证和机制验证。
主要模型
裸鼠皮下植入的口腔黏膜等效物模型 血管内皮样细胞（VELCs） 人牙龈上皮细胞（HGECs）和人牙龈成纤维细胞（HGFs）共培养体系
重点核对
VEGF165诱导GMSCs分化为VELCs的浓度（8 ng/mL）和时间（35天） 慢病毒转染的MOI值（20） 管形成实验中细胞密度（5×10^5 cells/mL） 体内植入后的观察时间点（4周） COL5A1/ANG对力学性能影响的检测
摘要
我们先前的研究已成功开发出组织工程血管化口腔黏膜等效物（VOME）；然而，仍面临重复性和稳定性低，以及无法精确模拟真实血管复杂性等挑战。因此，本研究旨在通过串联质谱标签（TMT）标记蛋白质组学结合激光捕获显微切割（LCM）以及人血管生成抗体芯片技术，筛选VOME和天然口腔黏膜的血管稳态表型。随后，构建慢病毒并稳定转染血管内皮样细胞（VELCs），以检测其血管生成能力。采用HE染色、EdU Apollo示踪染色、免疫荧光染色、扫描电子显微镜、生物力学测试和小动物超声成像系统，分析血管化稳态的特征，并监测血管化稳态表型口腔黏膜等效物（VHPOME）的功能再生。结果显示，PGAM1、COL5A1、ANG和RNH1是潜在的特异性血管生成表型。PGAM1、COL5A1、ANG的高表达和/或RNH1的低表达可促进VOME的血管生成。ANG/shRNH1具有最显著的管状结构形成能力。VHPOME组中PGAM1、COL5A1和ANG的表达高于对照组，而RNH1的表达低于对照组。COL5A1/ANG可显著改善力学性能。ANG/shRNH1组的血流信号最为显著。PGAM1、COL5A1、ANG、shRNH1、PGAM1/ANG、COL5A1/ANG、PGAM1/shRNH1、COL5A1/shRNH1和ANG/shRNH1可能是建立口腔黏膜等效物血管化稳态和功能再生的靶基因（组），其中ANG/shRNH1的作用最为显著。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过修饰血管稳态相关基因，提高口腔黏膜等效物的血管化能力和功能再生？
- 核心机制
- ANG与RNH1的相互作用影响血管生成，高表达PGAM1、COL5A1、ANG和/或低表达RNH1促进血管生成，其中ANG/shRNH1效果最显著；COL5A1/ANG可能通过促进胶原形成和血管生成改善力学性能。
- 主要证据
- 通过TMT蛋白质组学和抗体芯片筛选出关键蛋白，慢病毒转染VELCs后管形成实验显示ANG/shRNH1组管形成能力最强；体内实验中ANG/shRNH1组血流信号最显著，COL5A1/ANG组拉伸应变最大。
- 研究意义
- 为构建血管化稳态和功能再生的口腔黏膜等效物提供潜在靶点，可能应用于口腔颌面软组织缺损的修复重建。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选血管稳态表型相关蛋白
鉴定VOME与天然口腔黏膜差异表达的血管生成相关蛋白。
利用LCM获取血管样结构，进行TMT蛋白质组学和人血管生成抗体芯片分析，并通过Western blot验证关键蛋白表达。
验证ANG与RNH1的相互作用
确认ANG和RNH1在口腔黏膜等效物中的结合关系。
通过免疫共沉淀（co-IP）实验验证两者的结合。
构建慢病毒并转染VELCs
构建过表达或沉默相关基因的VELCs，用于后续功能实验。
设计并构建PGAM1、COL5A1、ANG过表达和shRNH1沉默的慢病毒，转染VELCs并筛选稳定株。
体外管形成能力测试
评估修饰后VELCs的血管生成能力。
将转染后的VELCs接种于Matrigel上，培养24小时后观察管状结构形成。
构建血管化稳态表型口腔黏膜等效物（VHPOME）
在体内验证修饰后的VELCs是否能促进血管化和功能再生。
将不同修饰的VELCs与HGECs、HGFs按序种植于ACVM-0.25% HLC-I支架构建复合体，皮下植入裸鼠，4周后取材分析。
评估VHPOME的血管化特征和功能
检测VHPOME的血管结构、血流信号及力学性能。
使用HE染色、免疫荧光、SEM、生物力学测试和小动物超声成像系统进行分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 血管内皮生长因子165 | -- | -- |
| 细胞染色 | EdU Apollo 488 | Apollo | -- |
| EdU Apollo 567 | Apollo | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 细胞培养 | 基质胶 | -- | -- |
| Western blot | GAPDH抗体 | Abways | AB0037 |
| ANG抗体 | Aidtech | E-7133 | |
| PGAM1抗体 | Bioss | bs-5006R | |
| RNH1抗体 | Bioss | bs-7518R | |
| CD54抗体 | Bioss | bs-0608R | |
| CD105抗体 | Bioss | bs-34063R | |
| CD51抗体 | Bioss | bs-2250R | |
| vWF抗体 | Sino Biological | 10973-T24 | |
| CD34抗体 | Boster | BA0532 | |
| Tie-2抗体 | Bioss | bs-1300R | |
| CD31抗体 | Boster | BA1346 | |
| COL5A1抗体 | Bioss | bs-0552R | |
| VEGFR1抗体 | SAB | 2904 | |
| VEGFR2抗体 | Affinity | AF4726 | |
| 小动物超声 | MX400探头 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| VELCs分化 | VEGF165浓度：8 ng/mL；诱导时间：35天 阅读提示：见“Construction of vascularized oral mucosa equivalents (VOME)”部分 |
| 慢病毒转染 | MOI值：20；筛选时间：约1周 阅读提示：见“Transfection and stability screening”部分 |
| 管形成实验 | 细胞密度：5×10^5 cells/mL；Matrigel体积：100μL/孔；培养时间：24小时；分组设置：11组，每组3个重复 阅读提示：见“Tube formation ability test”部分和Table 1 |
| 体内动物实验 | 动物品系：裸鼠（3-4周龄）；植入时间：4周；麻醉方法：戊巴比妥钠 阅读提示：见“Animals and acquisition of rabbit abdominal aorta”和“Construction of the vascularized homeostatic phenotypic oral mucosal equivalents (VHPOME)”部分 |
| 生物力学测试 | 拉伸速度：10 mm/min；样品准备：保持湿润 阅读提示：见“Tissue biomechanical properties test”部分 |