空间多组学图谱构建
建立人出生后胸腺组织的细胞类型和空间龛图谱，并比较性别差异。
对4-5月龄男性和女性胸腺样本进行CITE-seq、ATAC-seq和CODEX成像，整合分析细胞类型、转录组、表观基因组和空间位置。
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性别偏倚的人胸腺结构通过空间定义的龛引导T细胞发育
Sex-biased human thymic architecture guides T cell development through spatially defined niches.
实验完整度
高包含多组学测序（CITE-seq/ATAC-seq）、空间成像（CODEX）、体外功能验证（Notch配体筛选）及原代细胞培养等多层级验证。
主要模型
人出生后胸腺组织 脐带血来源CD34+ HSPCs
重点核对
年龄匹配的4-5月龄男性和女性胸腺样本（各3例） CD34+ HSPCs在JAG1、JAG2、DLL1、DLL4或无配体上培养，含0、2、20 ng/mL GM-CSF CD34+ HSPCs在JAG配体或无配体上培养3、5、7天后转移至DLL4 胸腺细胞在无饲养层培养中7天，检测HLA II类表达 Notch配体筛选实验重复3次，使用独立脐带血供体
摘要
在胸腺内，调控T细胞发育的细胞串扰依赖于特化龛内的空间相互作用。为了创建指导人出生后T细胞发育的组织龛的空间定义图谱，我们采用了多维成像平台共检测索引（CODEX）以及转录组和表位细胞索引测序（CITE-seq）和转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）。我们为男性和女性供者生成了年龄匹配的4至5个月大的人出生后胸腺数据集，识别出T细胞和胸腺生物学中的显著性别差异。我们证明了JAG配体在指导胸腺样树突状细胞发育中的可能作用，识别了细胞外基质（ECM）成纤维细胞群体的重要功能，并表征了围绕哈索尔小体的髓质龛。总之，这些数据代表了年龄匹配的空间多组学资源，用于研究基于性别的胸腺调控和T细胞发育差异如何产生，为理解男性和女性免疫功能及功能障碍的机制提供了重要资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类出生后胸腺的龛结构如何调控T细胞发育，并存在哪些性别差异？
- 核心机制
- JAG1在皮质-髓质交界处将早期胸腺祖细胞导向胸腺树突状细胞命运，而非T细胞谱系；皮质中胸腺细胞可能通过HLA II类介导的自选择支持阳性选择；Hassall小体通过15-PGDH调控前列腺素信号组织阴性选择龛。
- 主要证据
- 基于CODEX、CITE-seq和ATAC-seq的多组学分析识别了性别差异的细胞组成和信号通路；体外Notch配体筛选证明JAG1偏向DC发育；原代胸腺细胞培养显示DP上调HLA II类。
- 研究意义
- 提供了年龄匹配的空间多组学资源，用于研究男性和女性胸腺调控及T细胞发育差异的机制，并可能解释免疫功能及功能障碍的性别差异。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Notch配体功能筛选
验证JAG1等Notch配体对CD34+ HSPCs谱系分化的影响。
将脐带血CD34+ HSPCs培养在JAG1、JAG2、DLL1、DLL4或无配体上，添加不同浓度GM-CSF，检测T细胞和DC分化。
胸腺细胞培养验证自选择
检验在没有上皮细胞的情况下，未成熟和成熟DP是否能上调HLA II类并继续成熟。
分选未成熟DP（CD4+CD8+CD3-TCR-）和成熟DP（CD4+CD8+CD3+TCR+），在无饲养层培养7天，检测HLA II类表达和CD27+比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞多组学测序
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式分析 | CD3-APC-Cy7抗体 | BioLegend | 300425 |
| CD4-BB515抗体 | BD Biosciences | 566912 | |
| CD27-BV421抗体 | BioLegend | 356417 | |
| HLA-DR/DP/DQ-FITC抗体 | BioLegend | 361706 | |
| TCRαβ-APC抗体 | BioLegend | 306717 | |
| 细胞培养 | 含GlutaMAX的IMDM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31980030 |
| 不含维生素A的B27添加剂 | Gibco | 12587010 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 细胞因子处理 | 人重组SCF | R&D Systems | 255-SC |
| 人重组Flt3L | R&D Systems | 308-FK | |
| 人重组IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| 人重组TNFa | R&D Systems | 210-TA | |
| 人/恒河猴/猫重组CXCL12 | R&D Systems | 350-NS | |
| 细胞培养 | Immunocult人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂 | STEMCELL Technologies | 10970 |
| Costar 96孔透明平底聚苯乙烯组织培养板 | VWR | 29442-056 | |
| ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基 | STEMCELL Technologies | 10981 | |
| 细胞分离 | Lymphoprep密度梯度分离液 | STEMCELL Technologies | 07801 |
| 细胞培养 | 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140122 |
| RPMI培养基 | Life Technologies | 11875119 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| 细胞冻存 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 67-68-5 |
| 组织消化 | Stemxyme酶 | Cedarlane Labs | LS004113 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Fisher Scientific | 260913-10MU | |
| 细胞分离 | 牛血清白蛋白 | Wisent Bioproducts | 809-098-EL |
| Hank's平衡盐溶液 | Thermo Fisher Scientific | 14175103 | |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解缓冲液 | Millipore Sigma | 11814389001 |
| 流式分析 | 人Fc受体阻断剂 | BD Biosciences | 564220 |
| Zombie UV活/死染色 | BioLegend | 423108 | |
| ATAC-seq | 10X Genomics细胞核分离试剂盒 | 10X Genomics | -- |
| Notch配体筛选 | JAG1-Fc重组蛋白 | R&D Systems | 1277-JG-050 |
| JAG2-Fc重组蛋白 | R&D Systems | 1726-JG-050 | |
| DLL1-Fc重组蛋白 | R&D Systems | 10184-DL-050 | |
| DLL4-Fc重组蛋白 | Sino Biological | 10171-H02H-500 | |
| VCAM-Fc重组蛋白 | R&D Systems | 643-VM-200 | |
| 细胞培养 | BIT 9500血清替代物 | STEMCELL Technologies | 09500 |
| 低密度脂蛋白 | STEMCELL Technologies | 02698 | |
| 流式分析 | Brilliant Violet缓冲液 | BD Biosciences | 563794 |
| CODEX | DNA封闭寡核苷酸 | IDT | -- |
| 马来酰亚胺功能化寡核苷酸 | IDT | -- | |
| 免疫染色 | Triton X100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | MBD0015-5ML | |
| 山羊血清 | Millipore Sigma | G9023 | |
| Fluoromount G封片剂 | Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| 细胞分选 | Treg细胞分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 18063 |
| Miltenyi LD柱制备试剂盒 | Miltenyi Biotech Inc. | 130-042-901 | |
| CITE-seq | Chromium单细胞5'文库和凝胶珠试剂盒v1.1 | 10X Genomics | PN-1000165 |
| ATAC-seq | Chromium单细胞ATAC文库和凝胶珠试剂盒v2 | 10X Genomics | PN-1000390 |
| 细胞分选 | EasySep人CD34+阳性分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 17826 |
| 流式分析 | Cytofix/Cytoperm固定破膜试剂盒 | BD Biosciences | 554714 |
| 细胞分选 | MoFlo Astrios EQ分选仪 | Beckman Coulter | B52102 |
| BD Influx分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞计数 | Countess II FL自动细胞计数仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 单细胞测序 | 10X Genomics Chromium控制器平台 | 10X Genomics | -- |
| 共聚焦成像 | Zeiss LSM 900共聚焦显微镜配Airyscan | Zeiss | -- |
| 荧光成像 | Keyence BZ-X810荧光显微镜 | Keyence | -- |
| CODEX成像 | Akoya Biosciences Phenocycler成像系统 | Akoya Biosciences | -- |
| 测序 | NextSeq 2000测序仪 | Illumina | 20038897 |
| 流式分析 | CytoFLEX LX流式细胞仪 | Beckman Coulter | C40313 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 空间多组学分析 | 年龄匹配的4-5月龄男性和女性胸腺样本各3例；CITE-seq抗体panel 137个，CODEX panel 48个；样本处理流程（CD45-富集、CD25+CD8- Treg富集）；数据整合参数（聚类分辨率、维度数等） 阅读提示：STAR★Methods中CITE-seq和ATAC-seq数据整合与分析部分 |
| Notch配体筛选 | 脐带血CD34+ HSPCs的分离和培养条件；配体包被浓度（4 μg/mL）；细胞接种密度（JAG配体4000细胞/孔，DLL配体2000细胞/孔）；GM-CSF浓度（0、2、20 ng/mL）；培养时间（14天）；细胞因子组合（阶段1和阶段2） 阅读提示：STAR★Methods中Notch ligand in vitro screening部分 |
| 原代胸腺细胞培养 | 胸腺细胞分选标志物（CD4、CD8β、TCRαβ）；培养密度（1x10^6细胞/mL）；细胞因子组合（SCF、Flt3L、IL-7、TNFα、CXCL12等）；培养时间（7天）；检测指标（HLA-DR/DP/DQ、CD27） 阅读提示：STAR★Methods中Primary human thymocyte culture部分 |
| 免疫荧光分析 | 组织切片厚度（20μm）；固定和通透条件（PFA、Triton X100）；一抗浓度（Cytokeratin 5/8 1:100，CD4 1:100）；二抗浓度（1:500）；成像设备（Zeiss LSM 900） 阅读提示：STAR★Methods中Confocal Image Analysis部分 |