建立HDM诱导的哮喘模型及PepN预处理
验证PepN预处理对HDM诱导的过敏性气道炎症的影响
BALB/c小鼠在第-8、-5、-2天鼻内给予50 μg PepN，第0天用1 μg HDM致敏，第7-11天用10 μg HDM激发，对照组给予PBS。第14天处死小鼠，收集BALF和肺组织进行分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肺炎链球菌氨肽酶N预编程的CD11c高表达巨噬细胞的抗炎表型预防过敏性哮喘
The preprogrammed anti-inflammatory phenotypes of CD11chigh macrophages by Streptococcus pneumoniae aminopeptidase N safeguard from allergic asthma.
实验完整度
高包含体外BMDM培养、体内小鼠哮喘模型、细胞耗竭与过继转移、骨髓嵌合体、转录组分析及功能验证，证据层级独立。
主要模型
BALB/c小鼠HDM诱导的过敏性哮喘模型 小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM) THP-1细胞系 小鼠肺CD11c高表达巨噬细胞
重点核对
PepN预处理剂量：50 μg/只，鼻内给药 HDM致敏和激发方案：第0天1 μg致敏，第7-11天10 μg激发 氯膦酸盐脂质体耗竭CD11c高表达巨噬细胞的时间：第5天和第9天 CD11c高表达巨噬细胞过继转移数量：1.25×10^5细胞/只 BMDM过继转移数量：4×10^5细胞/只
摘要
背景：早期微生物暴露与过敏性哮喘的保护性相关。我们先前已证明肺炎链球菌氨肽酶N（PepN），一种肺炎球菌成分，在过敏性哮喘小鼠模型中抑制卵清蛋白（OVA）诱导的气道炎症，但其潜在机制尚未完全确定。方法：BALB/c小鼠用PepN蛋白预处理，并鼻内暴露于HDM过敏原。通过耗竭和过继转移实验以及转录组分析和分离的肺CD11c高表达巨噬细胞研究抗炎机制。结果：我们发现小鼠PepN预处理促进肺常驻F4/80+CD11c高表达巨噬细胞原位增殖，但也动员骨髓单核细胞浸润肺组织，然后转化为CD11c高表达巨噬细胞。PepN在成熟过程中通过塑造氧化磷酸化（OXPHOS）的代谢偏好，将巨噬细胞预编程为抗炎表型，并通过激活AMP活化蛋白激酶抑制巨噬细胞的炎症反应。此外，PepN处理的巨噬细胞还表现出高水平的共刺激信号分子，指导Treg分化。结论：我们的结果表明，PepN暴露后肺中CD11c高表达巨噬细胞的扩增和巨噬细胞的OXPHOS代谢偏向与过敏性气道炎症的减轻相关，这为其在预防过敏性哮喘中的应用铺平了道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肺炎链球菌氨肽酶N（PepN）预处理如何通过调节巨噬细胞从而抑制过敏性气道炎症？
- 核心机制
- PepN通过促进CD11c高表达巨噬细胞增殖和骨髓单核细胞募集并转化为CD11c高表达巨噬细胞，预编程巨噬细胞向OXPHOS代谢偏好和抗炎表型，并通过AMPK激活抑制炎症反应，上调共刺激分子促进Treg分化。
- 主要证据
- 通过HDM诱导的哮喘模型、氯膦酸盐脂质体耗竭和过继转移实验、骨髓嵌合体、RNA-seq、OCR和线粒体功能检测，显示PepN预处理增加CD11c高表达巨噬细胞，增强OXPHOS，降低mt-ROS和炎症因子，促进Treg分化。
- 研究意义
- 该研究为靶向CD11c高表达巨噬细胞预防和治疗过敏性哮喘提供了新思路，并为卫生假说提供了新的理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估PepN预处理对气道炎症和巨噬细胞亚群的影响
检测PepN预处理对炎症细胞浸润、Th2细胞因子及肺巨噬细胞亚群的影响
通过BALF细胞计数、Wright染色、肺组织H&E、PAS和甲苯胺蓝染色评估炎症；ELISA检测Th2细胞因子；流式细胞术分析F4/80+CD11c高/中/低巨噬细胞亚群。
验证CD11c高表达巨噬细胞的功能
确定CD11c高表达巨噬细胞在PepN抑制气道炎症中的作用
通过氯膦酸盐脂质体耗竭CD11c高表达巨噬细胞，并进行过继转移实验。耗竭实验在第5天和第9天鼻内给予氯膦酸盐脂质体；过继转移将分选的CD45+F4/80+CD11c高表达细胞（1.25×10^5）在第6天腹腔注射入HDM模型小鼠。
研究CD11c高表达巨噬细胞的来源
探究PepN增加CD11c高表达巨噬细胞是否通过促进增殖和/或募集骨髓来源细胞
通过EdU incorporation检测增殖；通过Western blot和Annexin V染色检测凋亡；通过骨髓嵌合体（胸廓屏蔽）和荧光素标记追踪骨髓来源细胞。
转录组和线粒体功能分析
探讨PepN预处理对CD11c高表达巨噬细胞代谢和表型的影响
对分选的CD11c高表达巨噬细胞进行RNA-seq；检测线粒体形态（TEM、共聚焦）、MMP、mt-ROS、OCR、复合物I活性、ATP生成；Western blot检测AMPK、STAT3、NF-κB等信号通路。
体外验证PepN对巨噬细胞成熟的影响
验证PepN在巨噬细胞成熟过程中是否直接赋予抗炎表型
用M-CSF从C57BL/6小鼠骨髓分化BMDM，在分化过程中和HDM刺激后给予PepN（10 μg/mL），检测OCR、ECAR、线粒体质量、mt-ROS、细胞因子分泌和AMPK激活。
BMDM过继转移实验
验证PepN预处理的BMDM在体内是否具有抗炎作用
将PepN预处理的BMDM（4×10^5）在首次激发前一天鼻内过继转移给HDM模型小鼠，评估气道炎症和细胞因子水平。
研究CD11c高表达巨噬细胞对Treg分化的影响
探究PepN诱导的CD11c高表达巨噬细胞是否促进Treg分化
耗竭CD11c高表达巨噬细胞后检测Treg比例；分离CD11c高表达巨噬细胞与naïve CD4+T细胞共培养，检测Treg分化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
哮喘模型建立与处理
细胞分离与培养
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ELISA | IL-4 ELISA试剂盒 | Biolegend | 431104 |
| IL-5 ELISA试剂盒 | Biolegend | 431204 | |
| IL-13 ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY413-05 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Biolegend | 430904 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Biolegend | 432604 | |
| IL-10 ELISA试剂盒 | Biolegend | 431414 | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Biolegend | 431304 | |
| CCL2 ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY479-05 | |
| 复合物I ELISA试剂盒 | Meimian | MM-44745M2 | |
| ATP ELISA试剂盒 | Meimian | MM-43789M2 | |
| Western blot | Caspase-8抗体 | R&D Systems | AF705-SP |
| Cleaved Caspase-3抗体 | CST | 9664 | |
| β-actin抗体 | Affinity | ab208670 | |
| AMPKα (D5A2)抗体 | CST | 5831 | |
| p-AMPKα(Thr172)抗体 | CST | 8208 | |
| Stat3 (124H6)抗体 | CST | 9139 | |
| p-Stat3 (Tyr705)抗体 | CST | 9145 | |
| p-NF-κB p65抗体 | CST | 3033T | |
| PD-L1抗体 | Abcam | ab213480 | |
| IL-1β抗体 | Abcam | ab254360 | |
| 山羊单克隆抗小鼠HRP | Biosharp | 21102333 | |
| 小鼠单克隆抗小鼠HRP | Biosharp | 21183464 | |
| 细胞处理 | 白消安 | Otsuka | 1E049A |
| 代谢检测 | 寡霉素 | Sangon Biotech | 1404-19-9 |
| FCCP | Macklin | C867805 | |
| 鱼藤酮 | Macklin | R817233 | |
| 葡萄糖 | Macklin | G6172 | |
| 2-脱氧葡萄糖 | Sangon Biotech | 154-17-6 | |
| 细胞处理 | 红细胞裂解液 | Biosharp Life science | BL503A |
| 细胞消化 | DNA酶I | Beyotime Biotechnology | D7073 |
| IV型胶原酶 | Solarbio | C8160 | |
| 固定 | 固定液（4%甲醛） | Biosharp Life science | BL539A |
| 细胞系 | THP-1 | National collection of Authenticated cell cultures | TCHu 57 |
| 动物实验 | HDM | Greer Laboratories | XPB82D3A25 |
| 流式细胞术 | F4/80抗体 | Biolegend | 123110 |
| CD11c抗体 | Biolegend | 117306 | |
| 增殖检测 | EdU流式试剂盒 | RiboBio | C10371-2 |
| 细胞培养 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Sino Biological | 51,112-MNAH |
| 胎牛血清 | Ausbian | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Biosharp Life science | BL505A | |
| RNA提取 | RNAiso Plus试剂 | TaKaRa | 9108 |
| RT-PCR | PrimeScript™ RT试剂盒 | TaKaRa | RR037A |
| qPCR | SYBR Green预混液 | TsingkeBiotechnologyCo.,Ltd. | TSE202 |
| 流式细胞术 | 抗CD16/32 | Biolegend | 101302 |
| APC偶联抗CD45 | Biolegend | 103112 | |
| PE偶联抗F4/80 | Biolegend | 123110 | |
| FITC偶联抗CD11c | Biolegend | 117306 | |
| APC偶联抗PD-L1 | Biolegend | 124311 | |
| PE偶联抗CD80 | Biolegend | 12-0801-81 | |
| BV605偶联抗CD4 | Biolegend | 116027 | |
| FITC偶联抗CD25 | Biolegend | 102006 | |
| PE偶联抗Foxp3 | Biolegend | 126404 | |
| 流式细胞仪 | FACSCantoTM | BD Biosciences | -- |
| 细胞分选 | FACSAriaTM II | BD Biosciences | -- |
| 核染色 | Hoechst 33342 | Beyotime Biotechnology | C1027 |
| 显微镜 | Leica DMI8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V FITC凋亡检测试剂盒 | BD Pharmingen | 556547 |
| 辐照 | 225 kV X射线照射仪 | Radsourse | -- |
| RNA-seq | NEBNext® Ultra™ RNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | -- |
| Qubit 2.0荧光计 | Thermo Fisher | -- | |
| 代谢检测 | OCR检测试剂盒 | Abcam | ab197243 |
| 糖酵解检测试剂盒 | Abcam | ab197244 | |
| Varioskan LUX | Thermo Fisher | -- | |
| 电子显微镜 | JEM-1400-FLASH | JEOL | -- |
| 线粒体染色 | Mito Tracker深红 | Thermo Fisher | M22426 |
| 线粒体ROS检测 | Mito SOX Red线粒体超氧化物指示剂 | Thermo Fisher | M36008 |
| 细胞分选 | CD4+T细胞分选磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-104-453 |
| 共培养 | 抗CD3e | eBioscience | 16-0031-81 |
| 抗CD28 | eBioscience | 16-0281-81 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 哮喘模型建立 | PepN预处理剂量（50 μg/只）、HDM致敏剂量（1 μg）和激发剂量（10 μg）、给药途径（鼻内）和时间点（第-8、-5、-2天；第0天；第7-11天） 阅读提示：Methods: Asthma model and PepN experimental therapies |
| 巨噬细胞耗竭 | 氯膦酸盐脂质体剂量（50 μl/只）和给药时间（第5天和第9天） 阅读提示：Methods: CD11chigh macrophages depletion and transfer |
| 过继转移 | 过继转移细胞数量（1.25×10^5）和转移时间（第6天） 阅读提示：Methods: CD11chigh macrophages depletion and transfer |
| BMDM培养 | M-CSF浓度（10 ng/mL）、FBS浓度（10%）、培养时间（7天） 阅读提示：Methods: Bone marrow derived macrophages isolation and culture |
| BMDM过继转移 | BMDM数量（4×10^5）、给药途径（鼻内）和时间（首次激发前1天） 阅读提示：Methods: BMDMs adoptive transfer model |
| RNA-seq | 差异表达基因筛选标准（adjusted P<0.05，|fold change|≥2） 阅读提示：Methods: RNA-seq |
| 代谢分析 | OCR和ECAR检测试剂盒（Abcam）、细胞培养条件 阅读提示：Methods: Cell oxygen consumption rate and Glycolysis assay analysis |
| 线粒体功能 | Mito Tracker浓度（400 nM）、Mito SOX浓度（5 μM）、染色时间 阅读提示：Methods: Confocal microscopy; Mitochondrial ROS and mitochondrial membrane potential measurement |
| Treg共培养 | 抗CD3e和抗CD28浓度（5 μg/mL）、细胞数量（AMs 2×10^5，CD4+T细胞1×10^6）、共培养时间（3天） 阅读提示：Methods: Isolation of CD4+T cells and co-culture with macrophages |