适配体筛选与鉴定
获得特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白的高亲和力DNA适配体。
采用粒子展示方法进行四轮筛选，以重组三聚体刺突蛋白为靶标，通过FACS分选获得富集池，经克隆测序获得四个共有序列，进一步通过结合实验和特异性实验选出两个最佳适配体（SpS1-C1和SpS1-C4），并测定其解离常数。
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基于高通量筛选DNA适配体的超灵敏无标记SERS生物传感器，用于临床样本中SARS-CoV-2变异株的通用检测
Ultra-sensitive label-free SERS biosensor with high-throughput screened DNA aptamer for universal detection of SARS-CoV-2 variants from clinical samples.
实验完整度
高实验涵盖适配体筛选（粒子展示）、结合特性验证（亲和力、特异性）、SERS平台构建与优化、重组蛋白检测，以及临床样本验证，包含多个独立证据层级，并包含功能验证。
主要模型
体外适配体筛选系统（粒子展示） 银纳米森林SERS底物 重组SARS-CoV-2刺突蛋白 临床鼻咽拭子样本
重点核对
适配体筛选过程中的靶标浓度梯度（10 nM至2 nM）和FACS分选门槛 适配体SpS1-C4的Kd值（1.81 ± 0.39 nM）及特异性（与S1亚基结合） SERS检测条件：785 nm激光，80 mW功率，1秒积分时间，10 μL样品，5分钟孵育 临床样本检测：80例鼻咽拭子（20例阴性，20例野生型，20例Delta，20例Omicron），通过RT-qPCR验证 ROC阈值设定（0.5575）及AUC值（野生型0.9975，Delta和Omicron为1.0）
摘要
COVID-19，即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2），已引起持续的全球大流行，造成经济和社会混乱。此外，该病毒持续快速进化出带有突变的新谱系。控制大流行最有效的策略是通过早期检测感染来抑制病毒传播。因此，开发一种快速、准确、易于使用的针对SARS-CoV-2关切变异株的诊断平台仍然必要。在此，我们开发了一种基于超灵敏无标记表面增强拉曼散射的适配体传感器，作为SARS-CoV-2关切变异株通用检测的对策。在该适配体传感器平台中，我们通过粒子展示（一种高通量筛选方法）发现了两种能够与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的DNA适配体。它们表现出高亲和力，解离常数为1.47 ± 0.30 nM和1.81 ± 0.39 nM。我们设计了适配体与银纳米森林的组合，以开发超灵敏SERS平台，并实现了对重组三聚体刺突蛋白的阿托摩尔（10⁻¹⁸ M）水平检测限。此外，利用适配体信号的内在特性，我们展示了一种无标记适配体传感器方法，无需拉曼标签即可使用。最后，我们的无标记SERS适配体传感器成功检测了SARS-CoV-2，即使在含有关切变异株（包括野生型、Delta和Omicron变异株）的临床样本中也具有极佳的准确性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种快速、准确、易于使用的诊断平台，用于SARS-CoV-2关切变异株的通用检测。
- 核心机制
- 通过DNA适配体特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白的S1亚基，导致适配体构象变化，从而改变SERS信号，实现无标记检测。
- 主要证据
- 利用粒子展示筛选出两个高亲和力适配体（Kd分别为1.47 nM和1.81 nM），并构建SERS适配体传感器，对重组刺突蛋白的检测限达240 aM；在80例临床样本（包括野生型、Delta和Omicron变异株）中，基于ROC曲线分析，获得高灵敏度特异性（AUC分别为0.9975、1、1）。
- 研究意义
- 该平台具有检测未来SARS-CoV-2变异株的潜力，并可推广用于其他病原体的快速经济诊断工具开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SERS底物制备与表征
制备具有高SERS增强效果的银纳米森林底物并验证其性能。
采用纳米溅射法制备银纳米森林底物，通过SEM、FTIR、XRD等手段表征其形貌和结构，并用罗丹明6G验证SERS增强效果，同时评估底物的重现性和抗干扰能力。
适配体固定与SERS检测
将适配体固定在SERS底物上，实现无标记检测重组刺突蛋白。
将巯基修饰的适配体通过TCEP处理后固定在银纳米森林表面，然后测量不同浓度重组三聚体刺突蛋白引起的SERS信号变化，确定检测限。
临床样本验证
验证aptasensor在临床样本中检测SARS-CoV-2变异株（野生型、Delta、Omicron）的性能。
使用80例鼻咽拭子样本（20例阴性，60例阳性包含三种变异株），通过SERS测量，用ROC曲线分析确定阈值并计算灵敏度和特异性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 适配体筛选 | MyOne磁珠 | Invitrogen | -- |
| GoTaq PCR预混液 | Promega Corporation | -- | |
| GoTaq聚合酶 | Promega Corporation | -- | |
| 脱氧核苷三磷酸 | Promega Corporation | -- | |
| SERS底物制备 | 银 | iNexus Inc. | -- |
| SERS测量 | 奥林巴斯正置显微镜 | Olympus | -- |
| 临床样本检测 | Standard M nCoV实时检测试剂盒 | SD Biosensor | -- |
| PowerChek SARS-CoV-2 S基因突变检测试剂盒 | Kogene Biotech | -- | |
| 适配体固定 | 三(2-羧乙基)膦盐酸盐 | Sigma-Aldrich | -- |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Biowest | -- | |
| 适配体筛选 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| 吐温-80 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 司盘-80 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 矿物油 | Sigma-Aldrich | -- | |
| SERS底物表征 | 罗丹明6G | Sigma-Aldrich | -- |
| 尼罗蓝A | -- | -- | |
| 结合试验 | 重组SARS-CoV-2刺突蛋白胞外域 | Sino Biological | 40589-V08H4 |
| 重组SARS-CoV-2刺突蛋白亚基1 | Sino Biological | 40591-V08H | |
| 重组SARS-CoV-2刺突蛋白亚基2 | Sino Biological | 40590-V08H1 | |
| 重组SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域 | Sino Biological | 40592-V08H |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 适配体筛选 | 筛选靶标（重组三聚体S蛋白）、靶标浓度梯度（10 nM至2 nM）、FACS分选门（0.1%-5%）、筛选轮数（4轮） 阅读提示：Methods 2.4-2.6, Results 3.1-3.2, Fig. 2 |
| SERS底物制备与表征 | 纳米溅射参数（400 mTorr、300 W、20°C）、底物尺寸（4×4 mm²）、SERS增强验证（R6G浓度系列） 阅读提示：Methods 2.8-2.9, Results 3.3, Fig. 4 |
| SERS检测条件 | 激光波长（785 nm）、激光功率（80 mW）、积分时间（1 s）、样品体积（10 μL）、孵育时间（5 min）、适配体浓度（1 μM） 阅读提示：Methods 2.9-2.10, Results 3.3 |
| 临床样本检测 | 样本类型（鼻咽拭子）、样本量（80例）、变异株种类（野生型、Delta、Omicron）、RT-qPCR验证试剂盒（Standard M nCoV、PowerChek） 阅读提示：Methods 2.11, Results 3.4, Fig. 5 |
| 数据分析 | ROC曲线分析、阈值设定（0.5575）、AUC计算 阅读提示：Results 3.4, Fig. 5E-H |