评估单载体Cas13系统的慢病毒递送效率
比较不同Cas13效应子在慢病毒载体中的递送和表达效率。
将LwCas13a、PspCas13b和RfxCas13d克隆至lentiCRISPR v2载体中，包装慢病毒感染多种细胞，通过嘌呤霉素筛选评估存活细胞数，并通过qPCR检测慢病毒RNA和整合DNA水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Cas13对宿主RNA的内在靶向限制了其效用
Intrinsic targeting of host RNA by Cas13 constrains its utility
实验完整度
高研究包含细胞模型实验、蛋白-RNA互作组学（RIP-seq）、转录组分析（RNA-seq）、生化酶活检测和高通量筛选等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制解析。
主要模型
HEK293FT细胞 A549细胞 T47D细胞 LNCaP细胞
重点核对
Cas13表达载体（单载体与双载体慢病毒系统） 慢病毒感染时的MOI（高>2或低0.3-0.5） 嘌呤霉素筛选浓度（A549、T47D、LNCaP分别为1、1.5、3.5 μg/ml） RIP-seq和RNA-seq分析中的细胞系（HEK293FT）
摘要
Cas13可用于RNA的敲低、编辑、成像或检测以及基于RNA的基因治疗。在此，通过使用RNA免疫沉淀测序、转录组分析、生化分析、高通量筛选和机器学习，我们展示了Cas13可以通过先前未被认识的机制在哺乳动物细胞中内在靶向宿主RNA。与其已知的顺式/反式RNA切割活性不同，Cas13还可以通过转录本特异性、不依赖于CRISPR RNA序列且动态依赖于Cas13构象状态的机制切割宿主RNA，我们针对编码在单载体和双载体慢病毒系统中的几个Cas13家族效应子证明了这一点。此外，参与病毒过程且其转录本被Cas13内在靶向的宿主基因有助于限制Cas13的慢病毒递送和表达。我们的发现为适当使用慢病毒Cas13系统提供了指导，并强调在基于Cas13的应用中需要对内在RNA靶向保持警惕。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究旨在探究Cas13效应子在慢病毒载体系统中应用受限的原因及其潜在机制。
- 核心机制
- Cas13能够通过不依赖于crRNA序列的、转录本特异性的内在RNA靶向机制切割宿主RNA，该机制涉及HEPN结构域和pre-crRNA加工活性，并受Cas13构象状态影响。
- 主要证据
- RIP-seq和RNA-seq显示Cas13结合并调控大量基因，体外切割实验证实Cas13可直接切割特定内源RNA片段，且HSPA6等功能基因的调控影响慢病毒包装效率，高通量筛选验证了不同Cas13系统的性能差异。
- 研究意义
- 研究为慢病毒Cas13系统的选择和使用提供了规则建议，并强调在Cas13应用中需警惕其内在RNA靶向活性可能带来的意想不到的影响。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估双载体慢病毒Cas13系统
探究Cas13蛋白与sgRNA cassette分离表达对慢病毒递送的影响。
构建Cas13蛋白和sgRNA cassette分别位于不同载体的双载体系统，分别包装慢病毒感染细胞，评估存活细胞数、慢病毒RNA和DNA水平。
鉴定Cas13的内在RNA靶标
识别Cas13在细胞内结合的RNA靶标，并分析其与慢病毒缺陷的关联。
在HEK293FT细胞中瞬时表达不同Cas13组件，进行RIP-seq和RNA-seq分析，鉴定Cas13结合峰和差异表达基因，并进行GO富集分析。
验证Cas13对内在RNA的切割活性
在体外验证Cas13是否能够不依赖crRNA直接切割内源RNA片段。
纯化Cas13蛋白，与体外转录的候选RNA片段共孵育，通过凝胶电泳检测RNA切割情况。
评估Cas13系统在高通量筛选中的性能
比较不同Cas13系统在慢病毒介导的高通量筛选中的适用性。
设计靶向蛋白编码基因和lncRNA的sgRNA文库，构建单、双载体Cas13d和双载体Cas13b筛选系统，在A375细胞中进行细胞适应性筛选，分析crRNA丰度变化和核心必需基因的β score。
开发机器学习模型预测crRNA特异性慢病毒缺陷
识别导致单载体Cas13d系统慢病毒缺陷的crRNA序列特征。
基于单载体Cas13d筛选数据，使用lasso回归模型分析早期缺失的靶向非必需基因的crRNA序列特征，并通过5折交叉验证评估模型性能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | lentiCRISPR v2 | Addgene | 52961 |
| lentiGuide-puro | Addgene | 52963 | |
| lenti-Cas9-blast | Addgene | 52962 | |
| pcDNA3.1-HA | Addgene | 128034 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | SEVEN Biotech | -- |
| 胎牛血清 | ExCell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio | -- | |
| 转染 | Neofect DNA转染试剂 | Neofect | -- |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 慢病毒生产 | pCMVR8.74 | -- | -- |
| pMD2.G | -- | -- | |
| 病毒滴度测定 | 慢病毒滴度试剂盒 | Applied Biological Materials (Abm) | -- |
| 蛋白质纯化 | HisPur钴树脂 | Thermo Fisher | 89964 |
| Zeba旋转脱盐柱 | Thermo Fisher | 89890 | |
| Amicon Ultra-15离心过滤装置 | Millipore | UFC905008 | |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Meilunbio | MA0082 |
| 体外转录 | T7 RNA聚合酶 | Lucigen | -- |
| RNA纯化 | RNA清洁与浓缩-5试剂盒 | Zymo Research | -- |
| RNA定量 | Qubit荧光计 | Thermo Fisher | -- |
| qPCR | UNIQ-10柱Trizol总RNA提取试剂盒 | Sangon | -- |
| MultiScribe逆转录酶 | Thermo Fisher | -- | |
| 2X UltraSYBR混合物 | CWBIO | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| FLAG抗体 | Invitrogen | MA1-91878 | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-25778 | |
| RPL13A多克隆抗体 | Solarbio | K008723P | |
| LY6E多克隆抗体 | Solarbio | K006299P | |
| PYCR3多克隆抗体 | Solarbio | K110275P | |
| DHRSX多克隆抗体 | Sino Biological | 202580-T08 | |
| HSPA6多克隆抗体 | Sino Biological | 202533-T34 | |
| IFIT2多克隆抗体 | Sino Biological | 205259-T08 | |
| OASL多克隆抗体 | Solarbio | K006805P | |
| RIP-seq | IgG抗体 | Santa Cruz | sc-2025 |
| Protein G磁珠 | Invitrogen | 10004D | |
| TRIzol LS试剂 | Life Technologies | -- | |
| TruSeq链式mRNA LT样品制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| RIP-qPCR | 抗HA磁珠 | Beyotime | P2121 |
| 抗FLAG磁珠 | Beyotime | P2115 | |
| 文库构建 | EndoFree Maxi-prep质粒提取试剂盒 | TIANGEN | 4992194 |
| Q5高保真DNA聚合酶 | New England Biolabs | -- | |
| 测序 | Illumina PE150测序平台 | Novogene | -- |
| MGI DNBSEQ-T7 PE150测序平台 | Novogene | -- | |
| PCR扩增 | DNA模板 | Synbio Technologies | -- |
| 数据分析 | GraphPad Prism | -- | 8.4.0 |
| ImageJ | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 慢病毒感染 | MOI（高>2或低0.3-0.5）、细胞类型、嘌呤霉素筛选浓度、感染后收集时间（48小时） 阅读提示：方法部分 'Lentivirus production and infection' 和 'Quantification of antibiotic-resistant cells, lentiviral RNA and DNA' |
| RIP-seq | 细胞系（HEK293FT）、转染质粒、甲醛交联浓度和时间（0.3%甲醛，10分钟）、抗体使用 阅读提示：方法部分 'RIP-seq' |
| 体外RNA切割实验 | Cas13蛋白浓度（200 nM）、RNA底物量（200 ng）、反应缓冲液（1× CutSmart）、反应时间和温度（37°C，2小时） 阅读提示：方法部分 'Cas13 cleavage assays' |
| 高通量筛选 | 细胞系（A375）、MOI（约0.3）、嘌呤霉素筛选浓度（1 μg/ml）、筛选时间点（Day 5和Day 33）、细胞覆盖率（约300X） 阅读提示：方法部分 'Pooled genome-wide Cas13 screens for cell fitness gene transcripts' |