体外药效评估
评估EriB联合HHT对t(8;21) AML细胞增殖和凋亡的影响
使用Kasumi-1和SKNO-1细胞，测定单药IC50和联合指数（Ci），并检测细胞活力、细胞计数和凋亡率。
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毛萼乙素与高三尖杉酯碱联合对t(8;21)急性髓系白血病发挥协同抗肿瘤作用
Combination of eriocalyxin B and homoharringtonine exerts synergistic anti-tumor effects against t(8;21) AML.
实验完整度
高包含细胞活力与凋亡检测、转录组与CUT&Tag分析、蛋白质互作与降解机制验证、动物移植瘤模型及患者样本验证等多层级证据。
主要模型
Kasumi-1细胞系 SKNO-1细胞系 共表达RUNX1-RUNX1T1和KITN822K的BALB/c小鼠骨髓移植模型 t(8;21) AML患者骨髓单个核细胞（BMMCs）
重点核对
细胞系：Kasumi-1、SKNO-1，培养条件（RPMI-1640，10%或20% FBS，SKNO-1需补充GM-CSF） 药物浓度：EriB（Kasumi-1 0.5 μM，SKNO-1 1 μM）、HHT（20 nM），处理时间（24小时） 体内给药：EriB 5 mg/kg，HHT 0.25 mg/kg，每日一次，连续7天 动物模型：共表达RUNX1-RUNX1T1和KITN822K的BALB/c小鼠，药物在移植后第7天开始 患者样本：t(8;21) AML伴KIT突变患者的BMMCs（n=5）
摘要
理解具有明确基因组异常的急性髓系白血病（AML）的分子发病机制促进了靶向治疗的发展。t(8;21) AML患者常携带融合基因RUNX1-RUNX1T1和KIT突变作为“二次打击”，使该疾病成为探索AML靶向治疗方案的理想模型之一。本研究探讨了靶向RUNX1-RUNX1T1和KIT的药物联合治疗伴有KIT突变的t(8;21) AML。我们发现，毛萼乙素（EriB）和高三尖杉酯碱（HHT）联合在体外通过双重抑制Kasumi-1和SKNO-1细胞中的RUNX1-RUNX1T1和KIT蛋白发挥协同治疗作用。在Kasumi-1细胞中，EriB和HHT联合可通过使RUNX1-RUNX1T1转录因子复合物（AETFC）不稳定、迫使RUNX1-RUNX1T1离开染色质、触发细胞周期阻滞和凋亡，从而扰乱RUNX1-RUNX1T1负责的转录网络。同时，EriB联合HHT激活JNK信号，最终通过caspase-3导致RUNX1-RUNX1T1降解。此外，HHT和EriB通过两种不同方式阻断p65核转位抑制NF-κB通路，协同干扰KIT的转录。在共表达RUNX1-RUNX1T1和KITN822K的小鼠中，EriB和HHT联合给药通过靶向CD34+CD38−白血病细胞显著延长了小鼠的生存期。在t(8;21) AML患者的骨髓单个核细胞（BMMCs）中也观察到两种药物的协同作用。总之，本研究揭示了EriB和HHT联合方案在t(8;21) AML中的协同机制，为优化AML的靶向治疗提供了新见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EriB联合HHT在t(8;21) AML中是否具有协同抗肿瘤作用，其机制是什么？
- 核心机制
- EriB通过使AETFC不稳定、减弱RUNX1-RUNX1T1的染色质结合能力，以及激活JNK-caspase-3通路促进RUNX1-RUNX1T1降解；同时EriB和HHT分别通过抑制经典NF-κB通路和NKRF-MYC轴，双重阻断p65核转位，协同抑制KIT转录。
- 主要证据
- 体外细胞活力、凋亡和蛋白质印迹实验；RNA-seq和CUT&Tag分析；SPR显示EriB与RUNX1-RUNX1T1/HEB直接结合；体内小鼠模型生存期延长；患者BMMCs验证凋亡和蛋白下调。
- 研究意义
- 为t(8;21) AML提供了一种可能优于常规化疗（如DA方案）且对CD34+细胞更具清除优势的联合治疗策略，为未来临床探索提供理论支持。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组和染色质结合分析
探究EriB联合HHT对RUNX1-RUNX1T1转录调控功能的影响
对处理9小时的Kasumi-1细胞进行RNA-seq和CUT&Tag分析，检测RUNX1-RUNX1T1的结合变化和下游基因表达。
机制验证
确认EriB联合HHT诱导RUNX1-RUNX1T1降解和抑制KIT表达的分子机制
通过Western blot、JC-1染色、细胞色素c释放和ChIP-qPCR验证JNK-caspase-3通路和NF-κB通路的作用。
体内疗效评估
评估EriB联合HHT在动物模型中的治疗效果和安全性
在共表达RUNX1-RUNX1T1和KITN822K的BALB/c小鼠中给药，监测外周血、脾脏、白血病细胞比例和生存期。
患者样本验证
在原发性t(8;21) AML样本中验证联合治疗的协同效应
从t(8;21) AML伴KIT突变患者骨髓中分离BMMCs，检测EriB和HHT单独或联合处理后的凋亡、活力和蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 毛萼乙素 | Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences | -- |
| 高三尖杉酯碱 | Hangzhou Minsheng Pharmaceutical | -- | |
| 达沙替尼 | Sigma-Aldrich | SML2589 | |
| JNK抑制剂IN 8 | Selleck | S4901 | |
| 多西环素 | Selleck | S5159 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Selleck | S1623 | |
| 多柔比星 | Selleck | S1208 | |
| 阿糖胞苷 | Selleck | S1648 | |
| Z-DEVD-FMK | Selleck | S7312 | |
| 肿瘤坏死因子α | Abclonal | RP00001 | |
| 重组蛋白 | 重组人CBFβ蛋白 | Sino Biological | 14569-H07E |
| 重组人RUNX1-RUNX1T1蛋白 | CUSABIO | -- | |
| 重组人HEB蛋白 | CUSABIO | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875-093 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | R&D Systems | 7954-GM | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| RNA-seq | RNeasy Micro试剂盒 | QIAGEN | 74004 |
| TruSeq RNA文库制备试剂盒v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| CUT&Tag | Hyperactive Universal CUT&Tag检测试剂盒 | Vazyme | TD903-01 |
| 抗RUNX1T1抗体 | Abcam | ab220347 | |
| 核/胞质分离 | Qproteome核蛋白提取试剂盒 | QIAGEN | 37582 |
| 线粒体分离 | 细胞线粒体分离试剂盒 | Beyotime | C3601 |
| ChIP-qPCR | ChIP-IT高灵敏度试剂盒 | Active Motif | 53040 |
| 抗p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| SYBR Green荧光染料 | QIAGEN | 204243 | |
| 免疫共沉淀 | 抗IgG抗体 | Santa Cruz | sc-2025 |
| 表面等离子共振 | Biacore T200分子相互作用仪 | Cytiva | -- |
| Biacore 8k分子相互作用仪 | Cytiva | -- | |
| NTA传感芯片 | Cytiva | 28994951 | |
| CM5传感芯片 | Cytiva | BR100012 | |
| PBS-P缓冲液 | Cytiva | 28995084 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | Kasumi-1、SKNO-1等细胞系的培养条件，包括培养基（RPMI-1640）、血清浓度（10%或20%）、SKNO-1需补充GM-CSF（10 μg/L） 阅读提示：Materials and methods: Cell lines |
| 体外药物处理 | EriB和HHT的浓度（EriB 0.5-1 μM，HHT 20 nM）、处理时间（9-48小时不等）、细胞密度 阅读提示：Figure legends 1, 2, 3, 4 |
| RNA-seq和CUT&Tag | Kasumi-1细胞处理条件（EriB 0.5 μM，HHT 20 nM，9小时），RNA提取和测序平台（NovaSeq 6000） 阅读提示：Materials and methods: RNA-seq and analysis; CUT&Tag |
| 动物实验 | BALB/c小鼠周龄（6周）、细胞移植方式（GFP标记的脾细胞）、给药方案（EriB 5 mg/kg，HHT 0.25 mg/kg，每日一次，连续7天）、给药起始时间（移植后第7天） 阅读提示：Materials and methods: Animal model; Figure legend 5 |
| 患者样本 | t(8;21) AML伴KIT突变患者的BMMCs（n=5），EriB和HHT处理浓度和时间 阅读提示：Materials and methods: Patient samples; Figure legend 6 |