建立CD44s过表达细胞模型
验证CD44s在管腔型乳腺癌细胞中的功能，并用于下游转录组分析。
通过慢病毒感染将CD44s cDNA导入MCF7和T47D细胞，嘌呤霉素筛选稳定细胞系，并用western blot验证过表达效率。
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CD44s激活的tPA/LRP1-NFκB通路驱动管腔型乳腺癌细胞片状伪足生长
CD44s-activated tPA/LRP1-NFκB pathway drives lamellipodia outgrowth in luminal-type breast cancer cells.
实验完整度
高包含体外细胞模型（MCF7、T47D）、转录组分析（RNA-seq）、功能验证（过表达、敲低、抑制剂）及机制验证（PI3K/Akt、NFκB等）。
主要模型
MCF7细胞（人乳腺癌细胞系） T47D细胞（人乳腺癌细胞系） CD44s过表达稳定细胞系（MCF7CD44s和T47DCD44s）
重点核对
CD44s过表达通过慢病毒感染建立，并经嘌呤霉素筛选（2 μg/mL）15天。 tPA敲低使用siRNA（序列：5'-CCCUCUCUUCAUUGCAUCCAU-3'）进行，检测对片状伪足形成的影响。 LRP1介导通过RAP（200 nM）抑制剂或LRP1 siRNA（序列：5'-GCUCAUCUCGGGCAUGAUU-3'）敲低验证。 PI3K/Akt通路验证使用LY294002（20 µM）抑制，检测tPA表达变化。 NFκB通路验证使用BAY 11-7082（10 µM）抑制，检测p65磷酸化及片状伪足形成。
摘要
一些癌细胞的迁移和转移以片状伪足突起（lamellipodia protrusions）的生长为特征，其潜在机制仍不清楚。已有证据证实，片状伪足的形成可由多种黏附分子（如CD44）调控，我们此前报道过，管腔型乳腺癌（BrCa）前缘的片状伪足富含CD44高表达。在本研究中，我们发现CD44s的过表达可通过诱导组织型纤溶酶原激活物（tPA）上调来促进BrCa细胞片状伪足的形成，该过程是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。此外，我们揭示了tPA可与LDL受体相关蛋白1（LRP1）相互作用以激活下游NFκB信号通路，进而促进片状伪足的形成。值得注意的是，抑制tPA/LRP1-NFkB信号级联可减弱CD44s诱导的片状伪足形成。因此，我们的发现揭示了CD44s通过tPA/LRP1-NFkB轴驱动管腔型BrCa细胞片状伪足生长的全新作用，这可能有助于寻找潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CD44如何调控管腔型乳腺癌细胞片状伪足的生长及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- CD44s通过激活PI3K/Akt信号通路上调tPA表达，tPA与LRP1相互作用，进而激活NFκB信号通路，最终促进片状伪足形成。
- 主要证据
- RNA-seq和qPCR显示CD44s过表达上调tPA；过表达CD44s促进片状伪足形成，敲低tPA或抑制PI3K/Akt、LRP1、NFκB均能减弱该效应。
- 研究意义
- 揭示了CD44s在管腔型乳腺癌中通过tPA/LRP1-NFkB轴驱动片状伪足形成的新作用，可能有助于寻找未来靶向治疗的新候选靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析鉴定CD44s下游靶基因
筛选CD44s过表达后表达变化的基因，寻找可能调节片状伪足形成的靶基因。
对MCF7vector和MCF7CD44s细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因，并进行GO、KEGG和GSEA富集分析。
验证CD44s促进片状伪足形成
确认CD44s过表达对管腔型乳腺癌细胞片状伪足形成的影响。
通过免疫荧光染色检测cortactin和F-actin分布，统计片状伪足阳性细胞比例；通过划痕愈合实验检测细胞迁移能力。
验证tPA在CD44s诱导的片状伪足形成中的作用
确认tPA是否是CD44s诱导片状伪足形成的关键下游介质。
在CD44s过表达细胞中敲低tPA，通过免疫荧光和划痕实验检测对片状伪足形成和迁移的影响。
研究PI3K/Akt通路调控tPA表达
探讨CD44s诱导tPA上调的信号通路机制。
通过KEGG和GSEA分析预测PI3K/Akt通路，用western blot检测Akt磷酸化水平，并用LY294002抑制PI3K/Akt后检测tPA表达。
鉴定tPA的膜受体LRP1
确定tPA发挥促片状伪足作用所需的膜受体。
使用EGFR抑制剂AG1478、Annexin A2抑制剂LCKLSL和LRP1抑制剂RAP处理CD44s过表达细胞，检测片状伪足形成和迁移变化，并用siRNA敲低LRP1进一步验证。
验证NFκB通路参与片状伪足形成
确认NFκB信号通路是tPA/LRP1轴下游调控片状伪足形成的关键通路。
通过Western blot检测p65磷酸化水平，并使用NFκB抑制剂BAY 11-7082处理细胞，检测片状伪足形成和迁移变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MCF7细胞 | ATCC | -- |
| T47D细胞 | ATCC | -- | |
| MEM培养基 | -- | -- | |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| Western blot | CD44抗体 | Abcam | ab189524 |
| tPA抗体 | Proteintech | 10147-1-AP | |
| cortactin抗体 | Abcam | ab81208 | |
| 磷酸化Akt抗体 | CST | 4060 | |
| Akt抗体 | CST | 4691 | |
| β-actin抗体 | CST | 3700 | |
| LRP1抗体 | Boster | BM4098 | |
| 磷酸化p65抗体 | CST | 3033 | |
| p65抗体 | CST | 8242 | |
| 药物处理 | LY294002 | Selleck | S1105 |
| 受体相关蛋白 | Sino Biological | 11100-H08H | |
| LCKLSL | MCE | HY-P2333A | |
| AG1478 | MCE | 153436-53-4 | |
| BAY 11-7082 | MCE | HY-13453 | |
| RNA提取 | RNAiso Plus | Takara Bio | 9108 |
| 反转录 | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara Bio | RR047Q |
| RT-qPCR | SYBR Green 预混液 | Takara Bio | RR820A |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Sigma Aldrich | BCA1 | |
| PVDF膜 | Millipore | ISEQ00010 | |
| 增强型化学发光检测 | Epizyme | SQ201 | |
| 免疫荧光 | 鬼笔环肽-iFluor 647试剂 | Abcam | ab176759 |
| 594标记的二抗 | Abcam | ab150077 | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Sigma Aldrich | -- |
| 免疫荧光 | 一抗稀释液 | Beyotime | P0256 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（ATCC）、培养基组分（MCF7：MEM+10%胎牛血清+10 μg/mL胰岛素；T47D：RPMI-1640+10%胎牛血清+7.5 μg/mL 胰岛素）、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：第2.1节 细胞培养和试剂 |
| CD44s过表达细胞建立 | CD44s cDNA载体（Ubi-MCS-SV40-IRES-puromycin）、慢病毒感染、嘌呤霉素筛选浓度（2 μg/mL）和周期（15天） 阅读提示：第2.2节 siRNA、质粒和慢病毒 |
| 转录组分析 | RNA-seq平台（Illumina Novaseq 6000）、差异表达基因筛选阈值（fold change >1.5，p < 0.05） 阅读提示：第2.3节 RNA测序和数据分析 |
| 划痕愈合实验 | 细胞密度（100%汇合）、划痕后培养条件（MEM+1% FBS，72小时） 阅读提示：第2.6节 划痕愈合实验；图2 |
| 免疫荧光 | 细胞固定（4%多聚甲醛）、透化（0.2% Triton X-100）、封闭（5% BSA）、一抗（CD44、cortactin）、二抗（594标记）、F-actin染色（Phalloidin-iFluor 647）、成像（Nikon A1共聚焦显微镜） 阅读提示：第2.7节 免疫荧光 |