小分子药物筛选
筛选能增强CAR T细胞杀伤肿瘤细胞的小分子化合物。
将MDA-MB-231-FFluc细胞单独或与B7-H3 CAR T细胞共培养（E:T=1:4），并分别加入624个小分子化合物（1 μM）处理24-48小时，通过发光检测肿瘤细胞活性；同时单独处理CAR T细胞检测表型。
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通过药物筛选发现增强癌症免疫治疗疗效的新型联合策略
A drug screening to identify novel combinatorial strategies for boosting cancer immunotherapy efficacy.
实验完整度
高包含体外细胞系筛选、3D肿瘤球实验、RNA-seq转录组分析、免疫缺陷小鼠异种移植模型及免疫活性小鼠原位模型，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
MDA-MB-231人乳腺癌细胞系 HCT116人结直肠癌细胞系 B7-H3 CAR T细胞 MC38和4T1小鼠肿瘤模型 M-NSG免疫缺陷小鼠异种移植模型
重点核对
筛查浓度为1 µM，处理时间24-48小时 异种移植模型中B7-H3 CAR T细胞剂量1×10^7，静脉注射，第7天和第14天 小鼠模型中JK184剂量5 mg/kg，腹腔注射，第7天至第17天 ICB抗体剂量100 μg，腹腔注射，第7天和第10天 效应细胞与靶细胞比例(E:T)为4:1, 1:1, 1:4
摘要
背景：嵌合抗原受体（CAR）T细胞和免疫检查点阻断（ICBs）在癌症治疗中取得了显著突破，但由于肿瘤抗原异质性和肿瘤免疫微环境，其对实体瘤的疗效仍然有限。受限的治疗效果促使我们寻找新的潜在治疗方法。方法：在本研究中，我们在人乳腺癌细胞系中进行了小分子化合物库筛选，以确定某些药物是否有助于CAR T细胞的杀伤。通过RNA测序预测了受筛选药物影响的肿瘤细胞和T细胞的信号通路。其中，JK184与CAR T细胞或ICBs联合的抗肿瘤活性在体外和体内进行了评估。结果：我们从化合物库中筛选出三种小分子药物，其中JK184通过抑制Hedgehog信号通路直接诱导肿瘤细胞凋亡，调节B7-H3 CAR T细胞向效应记忆表型分化，并在体外促进B7-H3 CAR T细胞的细胞因子分泌。此外，我们的数据表明，JK184在体内发挥抗肿瘤活性，并与B7-H3 CAR T细胞或ICBs强烈协同。机制上，JK184增强B7-H3 CAR T细胞在异种移植小鼠模型中的浸润。此外，JK184联合ICB通过增加效应T细胞浸润和炎症细胞因子分泌、抑制MDSCs的募集和M2型巨噬细胞的转化，显著重塑了免疫活性小鼠模型中的肿瘤免疫微环境。结论：这些数据表明，JK184可能是联合CAR T细胞或ICB治疗的潜在辅助药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 旨在筛选能够增强癌症免疫治疗（CAR T细胞和免疫检查点阻断）疗效的新型小分子药物。
- 核心机制
- JK184通过抑制Hedgehog信号通路直接诱导肿瘤细胞凋亡，并通过调节MAPK信号通路增强T细胞活性，促进效应记忆表型和细胞因子分泌；联合ICB时，通过重塑肿瘤微环境，增加效应T细胞浸润、减少免疫抑制细胞（Tregs、MDSCs）等，增强抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- 体外实验显示JK184抑制MDA-MB-231和HCT116细胞增殖并诱导凋亡，增强CAR T细胞杀伤；RNA-seq显示Hedgehog通路抑制和MAPK通路激活；体内异种移植模型显示联合治疗显著抑制肿瘤生长、延长生存；免疫活性小鼠模型中联合ICB显著缩小肿瘤并重塑免疫微环境。
- 研究意义
- 研究表明JK184可能成为CAR T细胞或ICB治疗的潜在辅助药物，为实体瘤免疫治疗提供新的联合策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外抗肿瘤活性验证
评估筛选出的药物（BML284、PPP、JK184）对肿瘤细胞和CAR T细胞的功能影响。
用MTT法测定药物对MDA-MB-231和HCT116的IC50；用Annexin V/7AAD检测凋亡；共培养实验检测CAR T细胞杀伤、穿孔素和颗粒酶B分泌；RTCA实时监测细胞活力；3D肿瘤球模型评估药物联合CAR T的肿瘤抑制。
转录组学机制分析
探索药物对肿瘤细胞和T细胞信号通路的影响。
对药物处理的MDA-MB-231细胞和T细胞进行RNA-seq，并进行GO、KEGG通路富集和GSEA分析；用qPCR验证关键基因表达。
体内异种移植模型评估
验证JK184联合B7-H3 CAR T细胞在体内的抗肿瘤效果。
将MDA-MB-231-FFluc或HCT116-FFluc细胞皮下注射至M-NSG小鼠，第7天和第14天静脉注射CAR T细胞，连续10天腹腔注射JK184或PBS，监测肿瘤生长和生存。
免疫活性小鼠模型评估联合ICB效果
评估JK184联合ICB在免疫活性小鼠中的抗肿瘤效果及对肿瘤微环境的影响。
将MC38或4T1细胞皮下接种至C57BL/6或BALB/c小鼠，第7天开始给予JK184，第7天和第10天给予抗PD1或抗CTLA4抗体，测量肿瘤体积和生存率，并通过流式分析肿瘤浸润免疫细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| T细胞培养 | 白细胞介素-2 | PeproTech | 200-02 |
| T细胞激活试剂 | Miltenyi Biotec | 130-111-160 | |
| X-vivo培养基 | Lonza | -- | |
| 白细胞介素-15 | PeproTech | 200-15 | |
| T细胞转导 | 重组人纤连蛋白片段 | TaKaRa | T100A/B |
| 化合物筛选 | 小分子化合物库 | TOPSCIENCE | L4000 |
| 细胞活力检测 | MTT试剂 | Sigma-Aldrich | CT02 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 细胞计数 | Countstar Rigel S5细胞计数仪 | Countstar | -- |
| 共培养实验 | xCELLigence实时细胞分析仪 | ACEA Biosciences | -- |
| 3D肿瘤球培养 | 超低吸附培养皿 | Corning | -- |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| B27添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| 人重组表皮生长因子 | Sino Biological | 10605-HNAE | |
| 人重组成纤维细胞生长因子 | Sino Biological | 10573-HNAE | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/7AAD凋亡检测试剂盒 | Meilunbio | MA0428 |
| 共培养标记 | CFSE细胞增殖示踪染料 | Biolegend | 423801 |
| 3D成像 | 钙黄绿素/碘化丙啶染色试剂 | Beyotime | C2015M |
| 流式细胞术 | Zombie NIR™可固定活力染料试剂盒 | -- | -- |
| LSR Fortessa流式细胞仪 | BD | -- | |
| FlowJo软件 | -- | v.10.6.1 | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| qPCR | PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR047A |
| SYBR Green预混液 | Vazyme | Q411-02 | |
| 免疫荧光 | 肌动蛋白绿色荧光探针 | Beyotime | C2201S |
| DAPI染色液 | Solarbio | C0060 | |
| 动物实验 | JK184 | -- | -- |
| 小鼠抗PD1抗体 | BioXcell | BE0146 | |
| 小鼠抗CTLA4抗体 | BioXcell | BE0131 | |
| 同型对照抗体 | BioXcell | BE0089 | |
| IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C4-BIOC | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | 10104159001 | |
| 70微米细胞筛网 | BD Falcon | -- | |
| 数据采集 | CLARIOstar酶标仪 | BMG LABTECH | -- |
| 动物成像 | IVIS小动物活体成像系统 | Caliper Life Sciences | -- |
| 显微成像 | 共聚焦显微镜 | Zeiss 880 | -- |
| 共聚焦显微镜 | Olympus IXplore SpinSR | -- | |
| 荧光显微镜 | Olympus DP80 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小分子药物筛选 | 细胞系MDA-MB-231-FFluc，B7-H3 CAR T细胞；化合物库（624种）浓度1 μM；处理时间48小时（肿瘤细胞）或24小时（CAR T细胞） 阅读提示：Methods 'Screening and viability assays'，Fig. 1A legend |
| 体外抗肿瘤活性 | MDA-MB-231和HCT116；药物浓度（IC50值）；处理时间24小时；共培养比例（E:T=1:1） 阅读提示：Methods 'Cytotoxicity assays'、'Cell proliferation assay'，Fig. 2 legend |
| RNA-seq分析 | 细胞系MDA-MB-231和T细胞；药物浓度1 μM；处理时间24小时；生物学重复数 阅读提示：Methods 'RNA-sequencing analysis'，图3和图4的图注 |
| 体内异种移植模型 | M-NSG小鼠；肿瘤细胞系MDA-MB-231-FFluc、HCT116-FFluc；注射细胞数2×10^6；CAR T细胞剂量1×10^7；JK184剂量5 mg/kg；给药方案 阅读提示：Methods 'In vivo treatments'，图5 legend |
| 免疫活性小鼠模型 | C57BL/6和BALB/c小鼠；肿瘤细胞系MC38和4T1；接种细胞数1×10^5；JK184剂量5 mg/kg；ICB抗体剂量100 μg；给药方案；肿瘤测量方法 阅读提示：Methods 'In vivo treatments'，图6和图7 legend |