生信分析筛选候选基因
鉴定与H. pylori感染和胃癌相关的关键基因
分析TCGA胃癌队列、本地队列和公共小鼠数据集，筛选差异表达基因，并与H. pylori感染小鼠数据取交集，得到60个差异基因，其中25个上调，聚焦CDK1。
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CDK1在胃癌发生中响应幽门螺杆菌感染连接NF-κB和β-catenin信号通路
CDK1 bridges NF-κB and β-catenin signaling in response to H. pylori infection in gastric tumorigenesis.
实验完整度
高包含体外细胞感染、体内小鼠模型、类器官培养及人类样本IHC等多个证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
AGS、MKN28、MKN45、GES1细胞系 C57BL/6小鼠模型 Krt19Cre/Cdk1flox/flox条件敲除小鼠 人胃癌组织样本
重点核对
H. pylori菌株：野生型cag+ 7.13、J166和PMSS1 感染复数：MOI=100:1 小鼠感染剂量：10^9 CFU/只 他莫昔芬处理：50 mg/kg，腹腔注射，10天 CDK1抑制剂：dinaciclib和RO3306
摘要
感染幽门螺杆菌是胃癌的主要风险因素，胃癌是全球癌症相关死亡的主要原因。细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）的致癌功能在胃癌发生中尚未完全阐明。利用公共数据集、实时定量PCR、蛋白质印迹和免疫组织化学分析，我们在人和小鼠胃肿瘤中检测到高水平的CDK1。幽门螺杆菌感染在体外和体内模型中诱导核因子κB激活，并显著增加CDK1（p < 0.01）。我们确认了CDK1启动子序列上活跃的NF-κB结合位点。CDK1通过直接结合磷酸化并抑制GSK-3β活性，随后积累并激活β-catenin。沉默CDK1或药理学抑制可逆转这些效应，并损害肿瘤类器官和球体形成。免疫组织化学分析显示CDK1与β-catenin呈正相关。结果表明感染、炎症和胃肿瘤发生之间存在机制联系，其中CDK1发挥关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- H. pylori感染如何通过NF-κB调控CDK1表达，以及CDK1在胃癌发生中的下游功能是什么？
- 核心机制
- H. pylori感染激活NF-κB，NF-κB直接结合CDK1启动子并上调CDK1表达；CDK1直接结合并磷酸化GSK-3β（Ser9），抑制其活性，导致β-catenin积累和核转位，激活β-catenin/TCF转录活性。
- 主要证据
- 通过ChIP和荧光素酶报告基因证实NF-κB结合CDK1启动子；体外激酶实验和共免疫沉淀证实CDK1与GSK-3β相互作用；细胞、小鼠和类器官实验显示CDK1沉默或抑制降低β-catenin水平及下游靶基因表达。
- 研究意义
- 揭示了CDK1作为连接感染、炎症和胃癌发生的分子桥梁，为胃癌治疗提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证H. pylori感染对CDK1表达的影响
验证H. pylori感染能否诱导CDK1表达
体外感染胃上皮细胞，体内感染小鼠，通过western blot、qRT-PCR和免疫荧光检测CDK1表达。
验证NF-κB调控CDK1转录
确定NF-κB是否直接结合CDK1启动子并调控其转录
通过ChIP、荧光素酶报告基因检测NF-κB与CDK1启动子的结合及转录调控。
验证CDK1激活β-catenin信号
验证CDK1能否激活β-catenin信号通路
过表达或敲低CDK1，检测β-catenin蛋白水平、核定位、TOP/FOP报告基因活性及下游靶基因表达。
验证CDK1与GSK-3β相互作用并磷酸化
验证CDK1是否直接与GSK-3β结合并磷酸化GSK-3β
通过PLA、共免疫沉淀和体外激酶实验检测CDK1与GSK-3β的相互作用及磷酸化。
体内验证CDK1对β-catenin的调控
在体内模型中验证CDK1基因敲除对H. pylori诱导的β-catenin激活的影响
使用Krt19Cre/Cdk1flox/flox小鼠建立对照、H. pylori感染、他莫昔芬处理及处理加感染组，感染PMSS1，检测胃组织及类器官中CDK1和β-catenin表达及下游靶基因。
评估CDK1抑制对细胞存活和扩增的影响
评估CDK1敲低或药理学抑制对胃癌细胞存活和球体形成的影响
使用shRNA敲低CDK1或使用CDK1抑制剂（dinaciclib、RO3306），进行球体培养和细胞活力检测。
分析人胃癌组织中CDK1和β-catenin表达
评估人胃癌组织中CDK1和β-catenin的表达及相关性
对胃癌组织微阵列进行IHC染色，评估CDK1和β-catenin表达，并进行相关性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证转录调控
分析信号通路活性
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | F12培养基 | GIBCO | -- |
| RPMI/1640培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | GIBCO | -- | |
| 胎牛血清 | Invitrogen Life Technologies | -- | |
| 青霉素/链霉素 | GIBCO | -- | |
| 转染 | PolyJet转染试剂 | Signagen Laboratories | SL100688 |
| LipoJet转染试剂 | Signagen Laboratories | SL100468 | |
| 细胞培养 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003 |
| B-27补充剂 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 人重组表皮生长因子 | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| 人重组碱性成纤维细胞生长因子 | Thermo Fisher | PHG0264 | |
| 类器官培养 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 小鼠基础培养基 | STEMCELL | -- | |
| 组织凝胶 | Richard-Allan | HG-4000-012 | |
| RNA提取 | RNeasy RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| Trizol试剂 | Invitrogen | -- | |
| RT-qPCR | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| Bio-Rad CFX Connect实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | Immobilon PVDF膜 | Millipore | -- |
| Protein A磁珠 | Invitrogen | -- | |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| PLA | Duolink原位PLA兔抗探针PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 |
| ChIP | ChIP-IT快速酶解试剂盒 | Active Motif | 53039 |
| ChIP-IT高灵敏度试剂盒 | Active Motif | 53040 | |
| 测序 | Tru-seq RNA文库制备试剂盒 | Illumina | RS-122-2001 |
| Illumina HiSeq 2500测序平台 | Illumina | -- | |
| 药物处理 | BAY 11-7082 | Selleckchem | S2913 |
| 人肿瘤坏死因子α | Peprotech | 300-01A-10ug | |
| 水溶性CDK1抑制剂IV，RO-3306 | Millipore Sigma | 217721-2MG | |
| Dinaciclib | Cayman Chemical | 14707 | |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Millipore Sigma | T5648-1G |
| 免疫印迹 | CDK1抗体 | Cell Signaling | 28439 |
| p-GSK3β(S9)抗体 | Cell Signaling | 9323 | |
| GSK3β抗体 | Cell Signaling | 5676 | |
| p-β-catenin(S552)抗体 | Cell Signaling | 5651 | |
| β-catenin抗体 | Cell Signaling | 8480 | |
| p-NFKB(S536)抗体 | Cell Signaling | 3033 | |
| NFKB抗体 | Cell Signaling | 8242 | |
| β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A1978 | |
| 免疫组织化学 | CDK1抗体（ab133327） | Abcam | ab133327 |
| β-catenin抗体 | Cell Signaling | 37447 | |
| 体外激酶实验 | GSK3B重组蛋白 | Sino Biological | 10044-H07B |
| CDK1重组蛋白 | RayBiotech Life | 230-00782-50 | |
| β-catenin重组蛋白 | ABclonal | RP01241 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞感染 | H. pylori菌株（7.13、J166）及感染复数（MOI=100:1） 阅读提示：STAR Methods，H. pylori strains 部分 |
| 小鼠感染 | 小鼠品系（C57BL/6、Krt19Cre/Cdk1flox/flox）、H. pylori菌株（PMSS1，10^9 CFU/只）、感染周龄（10-12周）、感染时长（1-2个月） 阅读提示：STAR Methods，Infection of mice with H. pylori 部分 |
| 他莫昔芬诱导敲除 | 他莫昔芬剂量（50 mg/kg，腹腔注射）、处理时长（10天） 阅读提示：STAR Methods，Infection of mice with H. pylori 部分 |
| 细胞培养 | 细胞系来源（AGS、MKN28、MKN45、GES1）、培养基、血清浓度（10% FBS） 阅读提示：STAR Methods，Cell culture and reagents 部分 |
| 球体培养 | 培养基成分（EGF、bFGF、B-27）、培养板（超低吸附6孔板）、培养时间（7天） 阅读提示：STAR Methods，Tumor spheroid culture 部分 |
| 类器官培养 | Matrigel用量（50 μL）、基础培养基（STEMCELL）、培养时间（14天） 阅读提示：STAR Methods，Gastric organoids 部分 |