模型建立
建立免疫检查点抑制剂相关心肌炎的小鼠模型。
通过给8-12周龄的雄性A/J小鼠腹腔注射150 μg抗PD-1单克隆抗体（克隆RMP1-14），每3天一次，共21天，诱导心肌炎。
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心肌肌球蛋白特异性自身免疫T细胞促进免疫检查点抑制剂相关心肌炎的发生
Cardiac myosin-specific autoimmune T cells contribute to immune-checkpoint-inhibitor-associated myocarditis.
实验完整度
高包含体外细胞表型分析、过继转移功能验证、动物体内模型及病理检测，多层级验证机制。
主要模型
A/J小鼠模型 CD4+ T细胞过继转移模型
重点核对
心肌肌球蛋白特异性T细胞的存在 PD-1抑制剂的给药方案 过继转移实验中的细胞处理和移植条件
摘要
免疫检查点抑制剂（ICIs）是治疗多种癌症的有效疗法；然而，它们可诱导免疫相关不良事件（irAEs）作为副作用。心肌炎是ICI治疗后发生的一种罕见但致命的irAE。目前，ICI相关心肌炎的机制尚不清楚。在这里，我们展示了仅通过抗PD-1单克隆抗体（mAb）给药，无需肿瘤细胞接种、免疫或病毒感染，即可在A/J小鼠中诱导心肌炎的发生。患有心肌炎的小鼠心脏浸润增加、心肌肌钙蛋白水平升高和心律失常。抗PD-1 mAb治疗还会导致其他器官的irAEs。识别心肌肌球蛋白的自身免疫T细胞在心肌炎小鼠中被激活并增加。值得注意的是，心肌肌球蛋白特异性T细胞存在于初始小鼠中，表现出抗原经历的T细胞表型。综上所述，我们建立了一个临床相关的ICI相关心肌炎小鼠模型，并发现心肌肌球蛋白特异性T细胞对ICI相关心肌炎的发展和发病机制的贡献。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究探讨免疫检查点抑制剂相关心肌炎的发病机制，特别是自身免疫T细胞介导的心脏自身免疫反应。
- 核心机制
- PD-1阻断通过激活心肌肌球蛋白特异性自身反应性T细胞，导致心肌炎症和损伤。
- 主要证据
- A/J小鼠使用抗PD-1抗体后出现心肌炎，伴有心脏浸润增加和肌钙蛋白水平升高；心肌肌球蛋白特异性CD4+ T细胞过继转移后可诱导心肌炎。
- 研究意义
- 本研究提供了一种临床相关的小鼠模型，有助于理解ICI相关心肌炎的发病机制，并为治疗策略提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
表型分析
评估PD-1抑制剂诱导的心肌炎的表型和免疫细胞浸润情况。
通过组织学染色（H&E）、心电图、血清cTnI水平检测、TUNEL凋亡染色和流式细胞术分析免疫细胞浸润。
T细胞表型和功能分析
确定心脏浸润T细胞的活化状态和细胞因子表达谱。
通过流式细胞术检测心脏T细胞CD62L、CD44、CD69表达，以及FACS分选的T细胞经RT-qPCR检测细胞因子和免疫检查点基因表达。
心肌肌球蛋白特异性T细胞分析
鉴定心肌肌球蛋白特异性自身免疫T细胞在心肌炎中的作用。
使用Myhc338-348/H-2Dd和Myhc334-352/I-Ak四聚体染色，通过流式细胞术检测心脏和淋巴器官中的肌球蛋白特异性T细胞，并分析其基因表达。
过继转移实验
验证心肌肌球蛋白特异性T细胞的致病性。
从免疫小鼠脾脏分离CD4+ T细胞，体外刺激后过继转移至亚致死辐照受体，并给予抗PD-1 mAb治疗，观察心肌炎发展。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型建立 | 抗小鼠PD-1单克隆抗体（克隆RMP1-14） | Bio X Cell | BE0146 |
| 大鼠IgG2a同型对照（克隆2A3） | Bio X Cell | BE0089 | |
| 抗小鼠CTLA-4单克隆抗体（克隆UC-10-4F10-11） | Bio X Cell | BE0032 | |
| 信号阻断 | 纯化抗CD16/CD32抗体（克隆93） | Thermo Fisher | 14-0161-86 |
| 流式细胞术 | BUV563抗小鼠CD45抗体（克隆30-F11） | BD Biosciences | 612924 |
| APC抗小鼠NKp46抗体（克隆29A1.4） | BioLegend | 137607 | |
| FITC抗小鼠CD11b抗体（克隆M1/70） | BioLegend | 101205 | |
| BV785抗小鼠Ly6G抗体（克隆1A8） | BioLegend | 127645 | |
| PE-Cy7抗小鼠F4/80抗体（克隆BM8） | BioLegend | 123113 | |
| BV711抗小鼠CD64抗体（克隆X54-5/7.1） | BioLegend | 139311 | |
| Alexa Fluor 700抗小鼠Ly6C抗体（克隆HK1.4） | BioLegend | 128023 | |
| BUV395抗小鼠CD19抗体（克隆1D3） | BD Biosciences | 565965 | |
| PE-Dazzle 594抗小鼠CD3抗体（克隆17A2） | BioLegend | 100245 | |
| BV421抗小鼠TCRγδ抗体（克隆GL3） | BioLegend | 118119 | |
| BV605抗小鼠CD4抗体（克隆GK1.5） | BioLegend | 100451 | |
| BUV805抗小鼠CD8抗体（克隆53-6.7） | BD Biosciences | 612898 | |
| BV421抗小鼠CD62L抗体（克隆MEL-14） | BioLegend | 104435 | |
| PE-Cy7抗小鼠CD44抗体（克隆IM7） | BioLegend | 103029 | |
| BUV395抗小鼠CD69抗体（克隆H1.2F3） | BD Biosciences | 740220 | |
| BV711抗小鼠PD-1抗体（克隆29F.1A12） | BioLegend | 135231 | |
| BV605抗小鼠TIM-3抗体（克隆RMT3-23） | BioLegend | 119721 | |
| 细胞分离 | 小鼠CD4 (L3T4)微珠 | Miltenyi | 130-117-043 |
| 体内补充处理 | 完全弗氏佐剂 | MilliporeSigma | F5881 |
| 重组小鼠IL-12p70 | PeproTech | 210-12 | |
| 细胞培养 | 重组小鼠IL-23 | Sino Biological | CT028-M08H |
| 重组小鼠IL-1β | Sino Biological | 50101-MNAE | |
| 组织消化 | II型胶原酶 | Worthington | LS004177 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Worthington | LS002139 | |
| 透明质酸酶 | MilliporeSigma | H3506 | |
| 细胞培养 | 正常大鼠血清 | Thermo Fisher | 31888 |
| RNA提取 | RNeasy Plus Micro试剂盒 | Qiagen | 74034 |
| RT-qPCR | iScript逆转录超混合液 | Bio-Rad | 7108841 |
| PowerUP SYBR Green预混液 | Thermo Fisher | A25742 | |
| 细胞活力测定 | LIVE/DEAD固定性Aqua死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher | L34966 |
| ELISA | 小鼠心肌肌钙蛋白I ELISA试剂盒 | Life Diagnostics | CTNI-1-US |
| 凋亡检测 | DeadEnd荧光TUNEL系统 | Promega | G3250 |
| 动物实验 | 雄性A/J小鼠 | Jackson Laboratory | 000646 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型建立 | 小鼠品系：A/J（雄性，8-12周龄）；给药剂量：150 μg抗PD-1 mAb/只；给药方式：腹腔注射；给药频率：每3天一次，持续21天；对照组：大鼠IgG2a同型对照。 阅读提示：详见STAR★Methods中的Mice部分 |
| 组织学分析 | 组织固定、石蜡包埋、切片厚度（4 μm）；H&E染色；心肌炎评分方法。 阅读提示：详见STAR★Methods中的Histology study部分 |
| 流式细胞术分析 | 抗体组合；染色步骤；四聚体染色（Myhc338-348-H-2Dd和Myhc334-352-I-Ak）；Fc阻断。 阅读提示：详见STAR★Methods中的Flow cytometry部分 |
| RNA表达分析 | 使用RNeasy Plus Micro Kit提取RNA；iScript逆转录；SYBR Green实时PCR；内参基因HPRT。 阅读提示：详见STAR★Methods中的Real-time RT-PCR部分 |
| 过继转移实验 | 供体小鼠免疫方案：Myhc334-352肽免疫两次（第0天和第7天）；脾细胞分离和体外刺激条件（50 μg/mL肽，20 ng/mL IL-23，10 ng/mL IL-1β，40 mM NaCl）；CD4+ T细胞纯化；受体辐照剂量（500 cGy）；细胞输注量（1×10^6细胞/只）；抗PD-1 mAb治疗。 阅读提示：详见STAR★Methods中的Adoptive transfer of T cells部分 |