疫苗设计与生产
快速生成针对B.1.1.529变异株的复制型RNA疫苗构建体
从GISAID选择B.1.1.529刺突序列(EPI_ISL_6699769)，设计并合成重叠DNA片段，通过Gibson组装克隆至repRNA骨架，体外转录并加帽，与LION纳米颗粒混合形成疫苗。
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复制型RNA平台能够快速应对SARS-CoV-2 Omicron变异株，并在未感染仓鼠中比祖先疫苗引发更强的保护力
Replicating RNA platform enables rapid response to the SARS-CoV-2 Omicron variant and elicits enhanced protection in naïve hamsters compared to ancestral vaccine.
实验完整度
高包含体外疫苗效力检测、小鼠免疫原性评估、仓鼠攻毒保护实验、病毒载量测定及组织病理学检查，证据层级独立且涵盖功能验证。
主要模型
C57BL/6小鼠 叙利亚金黄仓鼠 BHK细胞 VeroE6/TMPRSS2细胞
重点核对
B.1.1.529病毒株(hCoV-19/USA/GA-EHC-2811C/2021)的分离和鉴定 疫苗剂量(小鼠1 μg，仓鼠20 μg)和免疫途径(肌肉注射) B.1.1.529攻毒剂量(1000 TCID50)和途径(鼻内接种) 小鼠和仓鼠的免疫时间安排 中和抗体检测方法(PRNT80)和病毒载量检测(qRT-PCR, TCID50)
摘要
背景：2021年末，报道了SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) 变异株，其刺突蛋白具有多个突变，预计可增强传播性并使病毒逃逸中和抗体。在首次报告B.1.1.529后数周内，该变异株已迅速传播至全球，取代了先前流行的SARS-CoV-2毒株，即使在具有高水平疫苗和感染诱导免疫的人群中也导致COVID-19病例再次激增。研究表明，B.1.1.529对先前感染和针对早期SARS-CoV-2谱系开发的疫苗所提供的保护性抗体的敏感性较低。B.1.1.529即使在已接种疫苗的人群中也能传播，这导致了全球公共卫生对能够提供针对B.1.1.529保护的更新疫苗的需求。方法：我们快速开发了一种表达B.1.1.529刺突的复制型RNA疫苗，并在小鼠和仓鼠中评估了免疫原性。我们还用B.1.1.529攻击仓鼠，并评估了疫苗接种是否能防止病毒脱落和呼吸道组织内的复制。发现：我们发现，先前接种A.1特异性疫苗的小鼠在B.1.1.529靶向加强后未能提高针对B.1.1.529的中和抗体滴度，提示预先存在的免疫可能影响B.1.1.529靶向加强的效力。此外，我们发现，在单次接种每种疫苗后，用B.1.1.529变异株攻击的仓鼠中，我们的B.1.1.529靶向疫苗比祖先A.1靶向疫苗提供了更好的保护。解释：我们的数据表明，B.1.1.529靶向疫苗可能对B.1.1.529提供更好的保护，但为了获得最佳保护，可能需要考虑预先存在的免疫和加强时机。资助：这项研究部分由美国国家过敏和传染病研究所/国立卫生研究院校内研究计划、华盛顿研究基金会以及基金27220140006C (JHE)、AI100625、AI151698和AI145296 (MG)支持。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 更新为B.1.1.529靶向的复制型RNA疫苗能否提供比祖先A.1疫苗更好的免疫原性和保护效果，以及预先存在的免疫是否影响加强免疫效果？
- 核心机制
- B.1.1.529靶向疫苗诱导同源中和抗体，而A.1疫苗诱导的抗体对B.1.1.529交叉中和能力低；预先存在的A.1免疫可能干扰B.1.1.529特异性抗体的诱导。
- 主要证据
- 在未感染仓鼠中，单次接种B.1.1.529疫苗诱导了针对B.1.1.529的中和抗体(PRNT80 GMT 1:36)，而A.1疫苗未诱导交叉中和抗体；攻毒后，B.1.1.529疫苗减少了上下呼吸道病毒RNA和感染性病毒，而A.1疫苗仅减少鼻甲病毒载量。
- 研究意义
- 研究表明B.1.1.529靶向疫苗可能有必要用于预防B.1.1.529感染和传播，但需要考虑预先免疫和加强时机以优化保护性能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外效力验证
验证疫苗在体外表达的刺突蛋白的免疫反应性
将LION/repRNA系列稀释与BHK细胞孵育，24小时后ELISA检测细胞裂解物中刺突蛋白的S1和S2区域。
小鼠免疫原性评估
评估B.1.1.529疫苗在具有不同预先免疫状态的小鼠中的免疫原性
C57BL/6小鼠分为三组：A.1 Spike 2X、A.1 Spike 1X和Influenza HA 2X，然后接受两剂B.1.1.529疫苗加强，收集血清检测结合抗体和中和抗体。
仓鼠疫苗免疫原性与攻毒保护实验
比较单次接种A.1或B.1.1.529疫苗在仓鼠中的免疫原性和对B.1.1.529攻毒的保护效果
叙利亚仓鼠单次肌肉注射疫苗或盐水，28天后鼻内接种1000 TCID50 B.1.1.529，攻毒后第2、4天采集口腔拭子，第4天处死收集呼吸道组织，检测病毒RNA和感染性病毒。
组织病理学与免疫组化分析
评估疫苗对B.1.1.529感染引起的呼吸道病理变化和病毒抗原的影响
收集肺和头骨切片，H&E染色评估炎症，免疫组化检测SARS-CoV-2核蛋白抗原，由盲态病理学家评分。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 疫苗构建 | 脂质无机纳米颗粒 | HDT Bio | -- |
| BioXP | CodexDNA | -- | |
| 体外效力检测 | 抗SARS-CoV-2刺突蛋白S1结构域单克隆抗体 | Genetex | GTX632604 |
| 抗SARS-CoV-2刺突蛋白全长S一抗 | Abcam | Ab272504 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Genetex | GTX213110-01 | |
| ELISA | 酶标仪 | Bio-Tek Instruments Inc | ELX808 |
| 中和试验 | VeroE6-TMPRSS2细胞 | JCRB Cell Bank | JCRB1819 |
| 病毒分离 | 康宁Costar Spin-X离心管过滤器 | Corning | CLS8160 |
| ELISA | 重组A.1全长刺突蛋白 | Sino Biological | 40589-V08B33 |
| 重组A.1受体结合域 | Sino Biological | 40592-V08H | |
| 重组B.1.1.529受体结合域 | Sino Biological | 40592-V08H121 | |
| 抗小鼠IgG辣根过氧化物酶标记抗体 | Southern Biotech | 1031-05 | |
| 病毒RNA提取 | Qiagen RNA迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNEasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- | |
| RT-qPCR | QuantiFast探针PCR试剂 | Qiagen | -- |
| 组织学 | Sakura VIP-6组织处理器 | Sakura | -- |
| 免疫组化 | SARS-CoV/SARS-CoV-2核蛋白抗体 | Sino Biological | 40143-MM05 |
| ImPress VR抗鼠IgG聚合物 | Vector Laboratories | MP-7422 | |
| Discovery Ultra自动染色仪 | Ventana Medical Systems | -- | |
| ChromoMap DAB试剂盒 | Roche Tissue Diagnostics | 760-159 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 疫苗制备 | RNA与LION的比例（氮磷比15:1）、孵育条件（冰上30分钟） 阅读提示：Methods - Vaccine constructs |
| 小鼠免疫 | 小鼠品系、年龄、性别、疫苗剂量、注射体积和途径、免疫时间间隔、血清采集时间点 阅读提示：Methods - Mouse studies 和 Figure 2a |
| 仓鼠免疫与攻毒 | 仓鼠品系、年龄、性别、疫苗剂量、注射途径、攻毒病毒株、攻毒剂量和途径、采样时间点 阅读提示：Methods - Hamster studies 和 Figure 2d |
| 中和抗体检测 | 血清稀释系列、病毒株、病毒用量、细胞系、孵育时间和温度、空斑形成时间 阅读提示：Methods - Plaque reduction neutralization tests (PRNTs) |
| 病毒载量分析 | 组织处理、RNA提取试剂盒、定量PCR引物和探针、标准曲线、检测限 阅读提示：Methods - Viral RNA quantification |
| 组织病理学 | 组织固定、包埋、切片厚度、染色方法、抗体稀释度、评分标准 阅读提示：Methods - Histopathology and Immunohistochemistry |