HBEC ALI培养模型的建立与感染
建立人原代支气管上皮细胞的气-液界面培养模型，以模拟人呼吸道并检测供体间SARS-CoV-2感染差异。
从11位供体分离原代HBEC，在Transwell上分化21天。感染SARS-CoV-2（MOI 0.05或0.5），定期收集顶端和基底外侧样本，通过qPCR定量病毒载量。
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丝氨酸蛋白酶抑制剂限制宿主对SARS-CoV-2感染的易感性
Serine Protease Inhibitors Restrict Host Susceptibility to SARS-CoV-2 Infections.
实验完整度
高包含人原代支气管上皮细胞ALI培养的供体差异感染模型、转录组学、功能验证（过表达、重组蛋白处理）、机制验证（SPR、体外切割实验）及单细胞RNA测序等多层级证据。
主要模型
人原代支气管上皮细胞气-液界面培养模型 HEK-293T细胞过表达ACE2和TMPRSS2 Calu-3细胞 Vero E6细胞
重点核对
HBEC ALI培养的分化天数（21天） SARS-CoV-2感染剂量（MOI 0.05和0.5） 重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白处理浓度（20 ng/20 μL） 细胞系（Vero E6, HEK-293T, Calu-3） TMPRSS2和ACE2共表达
摘要
2019年冠状病毒病（COVID-19）是一种复杂的疾病，症状范围从无症状感染到具有致命结局的严重急性呼吸综合征。年龄、性别和合并症等个体因素会增加严重感染的风险，但遗传变异等其他方面也可能影响对SARS-CoV-2感染的易感性和疾病严重程度。在这里，我们使用基于来自多个供体的原代细胞的人源3D肺细胞模型，来鉴定调节SARS-CoV-2感染的宿主因子。通过基于转录组学的方法，我们发现不易感供体表现出更高水平的丝氨酸蛋白酶抑制剂SERPINA1、SERPINE1和SERPINE2的表达，从而将细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂水平的变异鉴定为限制SARS-CoV-2感染的宿主因子。我们将其抗病毒作用机制归因于抑制细胞丝氨酸蛋白酶TMPRSS2，从而阻止病毒刺突蛋白的切割和TMPRSS2介导的进入靶细胞。通过单细胞RNA测序，我们进一步将单个丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达定位到基底细胞、纤毛细胞、棒状细胞和杯状细胞。我们的结果增加了遗传变异作为SARS-CoV-2易感性决定因素的重要性，并提示细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂的遗传缺陷可能代表重症COVID-19的危险因素。我们的研究进一步强调了TMPRSS2作为抗病毒干预的有希望的靶点，并为局部给药丝氨酸蛋白酶抑制剂作为COVID-19治疗打开了大门。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 宿主遗传因素如何影响个体对SARS-CoV-2感染的易感性？
- 核心机制
- 丝氨酸蛋白酶抑制剂（SERPINA1、SERPINE1、SERPINC1）通过抑制TMPRSS2介导的刺突蛋白切割，阻断病毒进入。
- 主要证据
- 在HBEC ALI培养中，低易感组高表达SERPINA1、SERPINE1和SERPINE2；在HEK-293T细胞中，共表达serpin减少病毒进入；SPR显示serpin与TMPRSS2结合；体外切割实验显示serpin抑制TMPRSS2介导的S蛋白切割；重组serpin处理HBEC ALI培养减少感染。
- 研究意义
- 提示TMPRSS2是抗病毒干预的靶点，支持局部给药serpin作为COVID-19治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组学分析鉴定差异表达基因
鉴定与供体感染易感性相关的宿主基因表达差异。
对8个供体的HBEC ALI培养（感染和未感染）进行bulk RNA-seq，比较低易感组（group low）和高易感组（group high）的基因表达，结合GO富集分析。
验证serpin对SARS-CoV-2感染的抑制作用
验证SERPINA1、SERPINE1和SERPINC1是否能抑制SARS-CoV-2感染。
在HEK-293T细胞中共表达ACE2、TMPRSS2和serpin，感染SARS-CoV-2，检测病毒RNA、进入和负链RNA合成。
机制研究：serpin与TMPRSS2的相互作用
阐明serpin抑制TMPRSS2介导的刺突蛋白切割的机制。
通过表面等离子体共振（SPR）检测serpin与TMPRSS2的结合亲和力；通过体外切割实验检测serpin对TMPRSS2介导的S蛋白切割的抑制作用。
在HBEC ALI培养中验证重组serpin的抗病毒效果
验证重组serpin蛋白是否能减少HBEC ALI培养中的SARS-CoV-2感染。
在HBEC ALI培养顶端预先加入重组SERPINA1、SERPINE1或SERPINC1蛋白，感染SARS-CoV-2，监测病毒释放。
单细胞RNA测序定位serpin表达
确定SERPINA1、SERPINE1和SERPINE2在气道上皮细胞类型中的表达模式。
对两个供体的HBEC ALI培养进行单细胞RNA-seq，对细胞类型进行注释，分析serpin在不同细胞类型中的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Sigma-Aldrich | D5648 |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素-链霉素 | HyClone | -- | |
| 支气管上皮细胞培养基 | ScienCell | SC3211-b | |
| 支气管上皮细胞培养基补充物 | ScienCell | SC3262 | |
| Transwell插入式培养皿 | Corning | -- | |
| 牛垂体提取物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 人重组表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 视黄酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 病毒培养 | SARS-CoV-2/01/human/2020/SWE | -- | -- |
| 药物处理 | 重组SERPINE1蛋白 | R&D Systems | 1786-PI |
| 重组SERPINA1蛋白 | R&D Systems | 1268-PI | |
| 重组SERPINC1蛋白 | R&D Systems | 1267-PI | |
| 甲磺酸萘莫司他 | R&D Systems | 3081 | |
| 重组TMPRSS2 | Cusabio | CSB-YP023924HU | |
| 组织型纤溶酶原激活剂 | Sigma | T0831 | |
| 质粒转染 | SERPINE1-bio-His | Addgene | 52077 |
| SERPINA1-bio-His | Addgene | 52182 | |
| SERPINC1-bio-His | Addgene | 52076 | |
| pCSDest-HA-TMPRSS2 | Addgene | 154963 | |
| hACE2 | Addgene | 1786 | |
| RNA提取与RT-qPCR | QIAmp病毒RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| NucleoSpin RNA II试剂盒 | Macherey-Nagel | -- | |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| QuantiTect引物检测 | Qiagen | QT01680476 | |
| qPCRBIO SyGreen预混液Hi-ROX | PCR Biosystems | -- | |
| qPCRBIO探针预混液Hi-ROX | PCR Biosystems | -- | |
| StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫荧光 | SARS-CoV核衣壳蛋白抗体 | Sino Biological | 40143-R001 |
| 黏蛋白5AC抗体 | Thermo Fisher | MS-145-P | |
| 乙酰化微管蛋白抗体 | Sigma | T6793-0.2mL | |
| Hoechst33342 | Thermo Fisher | 62249 | |
| ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher | P10144 | |
| Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 细胞感染 | GeneJuice转染试剂 | Novagen | -- |
| 表面等离子体共振 | CM5传感芯片 | Cytiva | -- |
| Biacore T-200 | Cytiva | -- | |
| 体外切割实验 | ExpiCHO表达系统 | Gibco | -- |
| ExpiFectamine转染试剂 | Gibco | -- | |
| OptiPRO SF培养基 | Gibco | -- | |
| His-pure Ni-NTA树脂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Amicon Ultra-15离心过滤器 | Merck Millipore | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NuPAGE Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | -- | |
| SARS-CoV-2刺突蛋白抗体 | Novus Biologicals | NB100-56578 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Novex | A16104 | |
| Super Signal West Pico化学发光底物 | Thermo Scientific | -- | |
| Super Signal West Femto化学发光底物 | Thermo Scientific | -- | |
| Amersham Imager 680成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| ELISA | SERPINA1 ELISA试剂盒 | Abcam | ab108799 |
| SERPINE1 ELISA试剂盒 | Abcam | ab108891 | |
| 单细胞RNA-seq | 10x Chromium控制器 | 10x Genomics | -- |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HBEC ALI培养 | 原代HBEC来源、分化天数（21天）、细胞密度（0.75×10^5）、培养基成分、气-液界面培养条件 阅读提示：Materials and Methods - Generation of HBEC ALI cultures |
| 病毒感染 | 病毒株（SARS-CoV-2/01/human/2020/SWE）、感染剂量（MOI 0.05和0.5）、感染时间（2.5小时）、清洗步骤 阅读提示：Materials and Methods - Virus infection of HBEC cultures |
| 基因表达分析 | RNA-seq方法（Smart-seq2）、测序平台（Illumina NextSeq 500）、差异表达分析软件（DESeq2）、参考基因组 阅读提示：Materials and Methods - Bulk RNA sequencing |
| 重组serpin处理 | 重组蛋白浓度（20 ng/20 μL）、处理时间（感染前4小时，感染后每24小时）、给药途径（顶端） 阅读提示：Materials and Methods - Virus infection of HBEC cultures - Treatment with recombinant serpin proteins |
| 单细胞RNA-seq | 单细胞悬液制备、10x Genomics 3' protocol版本、细胞加载数量（13,200）、测序平台（NovaSeq 6000）、数据分析软件（Cell Ranger, SCANPY等） 阅读提示：Materials and Methods - Single-cell RNA-seq of HBEC ALI cultures |