小肠黏液特征与收集
比较不同年龄猪小肠黏液厚度、杯状细胞数量及黏液蛋白表达，并获取用于抗病毒实验的黏液样本。
通过荧光微球注射和CLSM测量黏液厚度，RT-qPCR检测杯状细胞标记基因表达，AB/PAS染色计数杯状细胞，从育肥猪空肠收集黏液。
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Calpain-1：在猪小肠黏液中鉴定的一种新型抗病毒宿主因子
Calpain-1: a Novel Antiviral Host Factor Identified in Porcine Small Intestinal Mucus.
实验完整度
高包含体外细胞感染模型、蛋白质分离纯化、分子结合与水解实验、动物攻毒保护实验等至少两个独立证据层级，并有功能验证与机制验证。
主要模型
Vero E6细胞 猪小肠黏液及黏蛋白组分 新生仔猪PEDV感染模型 293F细胞表达系统
重点核对
小肠黏液及总黏液蛋白抗PEDV活性测定（ plaque reduction assay） Muc2和组分III抗病毒作用及calpain-1依赖性验证（抗体阻断、抑制剂） calpain-1对PEDV S1蛋白的结合与水解（SPR、蛋白水解实验） 口服calpain-1对PEDV攻毒仔猪的保护效果（2.5 mg/kg）
摘要
覆盖肠上皮的厚黏液层因其在肠道感染中的保护作用而受到越来越多的关注。然而，黏液增强肠道抵抗病毒感染的确切机制仍 largely 不清楚。在此，我们鉴定出小肠黏液和提取的总黏液蛋白具有显著的抗病毒活性，其对猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染的抑制作用证明了这一点。在所有提取的黏液蛋白中，黏蛋白2和组分III（约70 kDa）表现出强效抗病毒活性。我们进一步评估了组分III中三种候选因子的抗病毒作用，发现calpain-1对其抗病毒活性贡献显著。体内研究表明，口服calpain-1可有效保护肠道免受PEDV感染。作为一种钙激活的半胱氨酸蛋白酶，calpain-1通过结合并水解病毒刺突蛋白的S1结构域来抑制病毒入侵。PEDV S1蛋白b结构域中氨基酸297至337之间的区域对calpain-1介导的水解至关重要。进一步研究表明，calpain-1可由肠上皮间的杯状细胞产生。综上所述，我们的研究结果揭示了calpain-1是猪小肠黏液中的一种新型抗病毒蛋白，表明calpain-1具有防御肠道感染的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 猪小肠黏液如何抵抗PEDV感染，以及其中的关键保护分子及其机制是什么？
- 核心机制
- calpain-1通过结合并水解PEDV刺突蛋白S1结构域（关键区域为氨基酸297-337）抑制病毒入侵，其水解作用依赖钙离子。
- 主要证据
- 体外实验显示calpain-1显著减少病毒斑形成并降解S1蛋白；SPR证实高亲和结合；口服calpain-1的仔猪肠道中PEDV RNA和蛋白显著降低。
- 研究意义
- 研究者认为calpain-1可能作为针对肠道感染的潜在抗病毒成分，对猪业及人类冠状病毒感染的防控有参考意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
黏液及总蛋白抗PEDV活性检测
评估小肠黏液及总黏液蛋白对PEDV感染的抑制作用，并确定其作用的病毒感染阶段。
采用空斑减少试验检测黏液和总蛋白的抗病毒效果，通过在不同感染阶段添加处理，结合病毒滴度和RNA检测确定作用阶段。
黏蛋白组分分离与抗病毒活性评估
分离不同分子量的黏液蛋白，鉴定具有抗PEDV活性的具体组分。
通过蛋白G亲和层析分离HMWPs，电洗脱分离LMWPs四个组分，检测各组分抗病毒活性，并进一步验证Muc2的作用。
鉴定组分III中calpain-1的抗病毒作用
确定组分III中发挥抗病毒活性的具体蛋白质。
通过SEC纯化组分III，LC-MS/MS鉴定蛋白质，筛选候选蛋白（转铁蛋白、HSP70、calpain-1）进行抗病毒验证，并用calpain抑制剂进一步验证。
calpain-1与PEDV S蛋白相互作用及水解机制
阐明calpain-1抑制PEDV入侵的分子机制，确定其结合和切割S蛋白的位点。
通过SPR检测calpain-1与S1蛋白的结合亲和力，体外蛋白酶解实验验证切割作用，构建S1缺失和点突变体确定关键区域，并通过TEM观察病毒形态变化。
calpain-1在肠组织的表达定位
验证calpain-1在猪小肠中的来源和表达水平。
通过Western blot和免疫组化检测不同年龄猪肠道不同节段的calpain-1表达，用免疫荧光共染Muc2和calpain-1确定杯状细胞中的定位。
口服calpain-1对PEDV攻毒仔猪的保护作用
评估口服calpain-1对新生仔猪PEDV感染的体内保护效果。
重组p-calpain-1通过293F细胞表达纯化，新生仔猪口服2.5 mg/kg后攻毒PEDV，观察临床症状，检测肠道组织病毒RNA和蛋白水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体检测 | 猪抗calpain-1多克隆抗体 | Bioss Antibodies | bs-1009R |
| 兔抗猪黏蛋白2单克隆抗体 | Abbexa Ltd. | abx177613 | |
| Muc2多克隆抗体 | Proteintech | 27675-1-AP | |
| 抗PEDV N蛋白单克隆抗体 | Medgene labs | -- | |
| 猪抗PEDV多克隆抗体 | VMRD Inc. | PC-IFA-PEDV | |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔Alexa Fluor 488 | Invitrogen | -- |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 594 | Invitrogen | -- | |
| 山羊F(ab')2抗兔IgG-(Fab')2，预吸附 | Abcam | ab102288 | |
| 抗体检测 | 兔(DA1E)单克隆抗体IgG XP同型对照 | Cell Signaling Technology | 3900 |
| 细胞染色 | DAPI | Thermo Fisher Scientific | 2313070 |
| 抗病毒实验 | 天然猪calpain-1蛋白 | Abcam | ab198675 |
| 天然猪黏蛋白2 (MUC2) | MyBioSource | -- | |
| HSP70/HSPA1A蛋白 | Sino Biological | 11660-H07H | |
| 转铁蛋白 | Sino Biological | 11019-H08H | |
| 抑制剂 | Calpeptin | Selleck Chemicals | -- |
| ELISA | 猪calpain-1 ELISA试剂盒 | Ruixing Biotechnology | SU-BN80625 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 庆大霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Yeasen | 40203ES60 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 反转录 | PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa Bio | -- |
| RT-qPCR | TB Green Premix EX Taq II | TaKaRa Bio | -- |
| 7500 Fast实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 黏液厚度测量 | DyLight 594标记乳胶珠 | Sigma | L3280 |
| 组织包埋 | OCT组织冷冻包埋剂 | Sakura | -- |
| 显微镜 | 共聚焦激光扫描显微镜 (LSM 710) | Zeiss | -- |
| 蛋白纯化 | 电洗脱仪 (型号422) | Bio-Rad Laboratories | -- |
| 蛋白定量 | Micro BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce Biotechnology | -- |
| 蛋白分离 | Zenix SEC-150凝胶过滤柱 | -- | 3 μm, 150 Å, 7.8 × 300 mm |
| AKTA纯化系统 | GE Healthcare | -- | |
| 质谱分析 | Q-Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY nLC1000纳升超高压液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白纯化 | HiTrap NHS活化HP柱 | GE Healthcare | -- |
| SPR | Biacore S200仪器 | GE Healthcare | ATC-018 |
| CM5传感芯片 | GE Healthcare | -- | |
| 蛋白表达 | 无内毒素质粒大提试剂盒 | Qiagen | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA柱 | -- | -- |
| 酶活性检测 | Calpain活性荧光检测试剂盒 | Biovision | -- |
| 圆二色谱 | J715圆二色谱仪 | JASCO Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 黏液厚度测量 | 猪的年龄（新生、断奶）、麻醉剂量、乳胶珠浓度、观察时间 阅读提示：Methods: Measurement of mucus thickness; Fig. S1A |
| 细胞培养与病毒感染 | 细胞系、培养基、FBS浓度、MOI、感染时间 阅读提示：Methods: Cell line, viruses, and infection |
| 空斑减少试验 | 细胞密度、病毒量、蛋白处理浓度、孵育温度和时间 阅读提示：Methods: Plaque reduction assay |
| RT-qPCR | 引物序列、内参基因、PCR条件 阅读提示：Methods: RT-qPCR; Table 1 |
| 黏液蛋白分离 | PAGE条件、电洗脱参数、SEC柱规格 阅读提示：Methods: PAGE and electroelution; Mucus protein separation using size-exclusion chromatography |
| calpain-1纯化 | 抗体偶联、柱平衡、洗脱条件 阅读提示：Methods: Purification of calpain-1 |
| SPR结合实验 | 固定密度、缓冲液成分、流速、蛋白浓度范围 阅读提示：Methods: Surface plasmon resonance (SPR) |
| 蛋白水解实验 | 底物和酶比例、钙离子浓度、温度、时间 阅读提示：Methods: Proteolytic cleavage assay |
| 动物攻毒实验 | 猪的日龄、分组、给药剂量、攻毒剂量、观察终点 阅读提示：Methods: PEDV challenge experiments |