构建结合模块并表征
验证多价适配体组装到TDF上的可行性及其结合特异性。
通过一步自组装构建TriApTDF，利用琼脂糖凝胶电泳（AGE）分析组装产物，使用TIRFM验证适配体化学计量，并用冷冻电镜观察形态。
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DNA纳米组装对SARS-CoV-2感染的力学感知视角
Mechanosensing view of SARS-CoV-2 infection by a DNA nano-assembly.
实验完整度
高包含体外细胞模型（ACE2表达HEK293T细胞）、伪病毒实验、分子结合测定（Kd值）、以及粗粒化模拟（DPD），并进行了功能验证（感染效率比较）和机制验证（机械力测量）。
主要模型
SARS-CoV-2伪病毒（野生型、K417N/E484K/N501Y变异株、L452R/E484Q/P681R变异株） ACE2表达HEK293T细胞
重点核对
机械力测量实验中使用的TGT系列张力值（4.7、9.6、12、23、33、43、56 pN） 伪病毒颗粒浓度（约10^6 particles/mL） ACE2表达HEK293T细胞的培养条件（高糖DMEM、10% FBS、1%青霉素-链霉素，37°C、5% CO2） 感染实验中使用的伪病毒浓度（与机械力实验一致）和感染时间（8小时共孵育后更换培养基，再培养48小时） SA芯片修饰步骤（MPTS、GMBS、SA浓度和孵育时间）
摘要
病毒与宿主细胞之间的机械力在病毒感染中起着关键作用。然而，在整个病毒水平上表征病毒-细胞机械力仍然是一个挑战。在此，我们开发了一个平台，通过多价控制的适配体锚定病毒，实现将病毒-细胞机械力传递到DNA张力计栓系（Virus-TGT）。当TGT断裂时，结合模块-病毒-细胞的复合物从基底上分离，伴随宿主细胞-基底粘附减少，从而揭示整个病毒与细胞之间的机械力。利用Virus-TGT，我们获得了关于SARS-CoV-2与宿主细胞之间生物力学力的直接证据。测量了野生型病毒与细胞和变异病毒与细胞在细胞水平上的相对机械力差距（<10 pN），表明病毒-细胞机械力与传染性之间可能存在正相关。总体而言，该策略为探测SARS-CoV-2机械力提供了新的视角。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究旨在探究SARS-CoV-2与宿主细胞之间的整体机械力如何影响病毒感染，并比较野生型与变异株的机械力差异及其与感染性的关系。
- 核心机制
- 病毒与宿主细胞之间的机械力可能通过影响S蛋白与ACE2的结合稳定性及后续的膜融合过程来调节病毒感染性。研究提出机械力可能比S蛋白-ACE2亲和力更能预测病毒感染性。
- 主要证据
- 通过Virus-TGT平台，测量了野生型SARS-CoV-2伪病毒与宿主细胞间的机械力为4.7-9.6 pN，而K417N/E484K/N501Y变异株和L452R/E484Q/P681R变异株均为9.6-12 pN。同时，感染效率测定显示野生型感染效率为45.0%，变异株分别为70.8%和67.9%，表明机械力与感染效率呈正相关。此外，DPD模拟显示L452R/E484Q/P681R变异株与ACE2膜的结合能（-308 kBT）显著高于野生型（-186 kBT），支持机械力差异。
- 研究意义
- 该策略提供了一个新的平台来研究病毒感染的生物力学力，有助于深入理解感染机制和病毒突变的影响，并可用于评估中和抗体等中和剂的效力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证结合模块与病毒复合物的稳定性
确保结合模块与病毒之间的结合力强于病毒与细胞的结合力，以便有效传递力。
通过生物素化RBD与Ni磁珠结合，测量TriApTDF与不同RBD的Kd值；并用Cy5标记结合模块构建Virus-TGT，观察低张力和高张力条件下的细胞粘附差异。
测量SARS-CoV-2伪病毒与宿主细胞间的机械力
使用不同张力耐受性的DNA栓系，确定病毒-细胞机械力的范围。
将伪病毒与结合模块-TGT复合物孵育，然后加入宿主细胞，通过荧光显微镜成像并量化保留的细胞数量，以评估不同张力TGT下细胞粘附情况，从而推断机械力范围。
比较感染效率
确定不同SARS-CoV-2伪病毒在相同颗粒浓度下的感染效率，并分析其与机械力的关系。
将ACE2表达HEK293T细胞种子384孔板，加入等浓度伪病毒，共孵育8小时后换液，继续培养48小时，计数荧光细胞评估感染效率。
粗粒化模拟
通过DPD模拟比较野生型和L452R/E484Q/P681R变异株与ACE2表达细胞膜的结合能，进一步验证机械力差异。
构建包含S蛋白（PDB: 7DDN和7VXE）和ACE2（PDB: 1R4L）的CG模型，使用Martini力场进行DPD模拟，计算结合能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 结合模块组装与表征 | 三价适配体-TDF结合模块 | -- | -- |
| 结合亲和力测量 | His标签RBD偶联的镍磁珠 | GE Healthcare | 17-5268-01 |
| SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-His重组蛋白 | Sino Biological | 40592-V08B | |
| SARS-CoV-2刺突蛋白RBD（K417N/E484K/N501Y）-His重组蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H85 | |
| SARS-CoV-2刺突蛋白Delta RBD（L452R/T478K）-His重组蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H90 | |
| 机械力测量 | 生物素化ACE2 | Sino Biological | 10108-H08H-B |
| SARS-CoV-2假病毒 | Fubio Biological Technology | FNV215 | |
| SARS-CoV-2假病毒（K417N/E484K/N501Y） | Fubio Biological Technology | FNV3327 | |
| SARS-CoV-2假病毒（L452R/E484Q/P681R） | Fubio Biological Technology | FNV3609 | |
| 芯片修饰 | 链霉亲和素 | Sigma-Aldrich | -- |
| (3-巯基丙基)甲基二甲氧基硅烷 | Sigma-Aldrich | -- | |
| N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 凝胶电泳 | DNA marker（20-500 bp） | Takara | 3420A |
| DNA marker（100-2000 bp） | Sangon Biotechnology | -- | |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco | -- | |
| 冷冻电镜 | 铜网（Lacey碳膜，300目） | Ted Pella | 01895-F |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 冷冻电镜（Talos F200C G2）配Ceta CCD相机 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜（Nikon Ts2R-FL） | Nikon | -- |
| 流式分析 | FACSVerse流式细胞仪 | BD | -- |
| 模拟 | GROMACS（Martini模型） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 结合模块制备 | DNA序列（表S1）、浓度配比、退火条件（95°C 10 min，冷却至4°C 20 min）、缓冲液（TM缓冲液） 阅读提示：见Methods部分“Preparation and characterization of the binding module” |
| 芯片修饰 | MPTS浓度（5%乙醇）、GMBS浓度（0.5 mg/mL）、SA浓度（25 μg/mL）、孵育时间（MPTS 2 h，GMBS 30 min，SA 2 h或4°C过夜） 阅读提示：见Methods部分“SA slide chip modification” |
| 机械力测量 | 结合模块-TGT复合物浓度（1 μM）、伪病毒浓度（约10^6 particles/mL）、细胞孵育时间（3 h） 阅读提示：见Methods部分“Virus-TGT measurement” |
| 感染效率实验 | 细胞数（约10^4）、伪病毒浓度（文中未明确具体数值，但应保持一致）、共孵育时间（8 h）、总培养时间（58 h） 阅读提示：见Methods部分“SARS-CoV-2 pseudovirus infection assay” |