单细胞RNA测序鉴定差异表达基因
比较原发肿瘤和肺转移细胞的转录组，识别转移起始相关基因
从PDX和MDA-MB-231肿瘤中分选单个肿瘤细胞，进行单细胞RNA测序，分析原发和转移细胞的差异表达基因。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ICAM1启动乳腺癌肺转移中循环肿瘤细胞簇的形成和跨内皮迁移
ICAM1 initiates CTC cluster formation and trans-endothelial migration in lung metastasis of breast cancer.
实验完整度
高研究包含单细胞RNA测序、PDX模型、细胞系功能实验（敲低/过表达）、体外聚集和跨内皮迁移实验、体内转移模型及患者样本分析，并进行机制验证。
主要模型
TNBC PDX模型（TN1、TN2、TN3） MDA-MB-231细胞系 HUVEC内皮细胞 NSG小鼠
重点核对
ICAM1在肺转移中的表达水平（PDX模型和TCGA数据） siRNA敲低或过表达ICAM1对CTC簇形成和肺转移的影响 ICAM1同亲和性相互作用的验证（共免疫沉淀和结构建模） 抗ICAM1中和抗体在体内外对转移的抑制作用 CDK6作为ICAM1下游靶点的验证
摘要
与单个细胞相比，循环肿瘤细胞（CTC）簇以更高的效率介导转移，并与乳腺癌患者的总生存期较低相关。结合单细胞RNA测序和蛋白质分析，我们报告了三阴性乳腺癌（TNBC）原发肿瘤细胞和肺转移的图谱。在三个TNBC患者来源的异种移植瘤（PDX）的肺转移中，ICAM1表达增加了200倍。ICAM1的缺失通过抑制同型肿瘤细胞-肿瘤细胞簇的形成，消除了TNBC细胞的肺定植。基于机器学习算法和诱变分析确定了负责同亲和性ICAM1-ICAM1相互作用的ICAM1区域，从而指导同型肿瘤细胞聚集，以及用于跨内皮迁移的异型肿瘤-内皮粘附。此外，ICAM1通过激活与细胞周期和干性相关的细胞通路促进转移。最后，阻断ICAM1相互作用显著抑制CTC簇形成、肿瘤细胞跨内皮迁移和肺转移。因此，ICAM1可作为TNBC转移起始的新型治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ICAM1在三阴性乳腺癌转移起始（特别是CTC簇形成和跨内皮迁移）中的作用和机制是什么？
- 核心机制
- ICAM1通过同亲和性ICAM1-ICAM1相互作用介导同型肿瘤细胞聚集形成CTC簇，并促进肿瘤-内皮异型粘附及跨内皮迁移，同时激活细胞周期和干性相关通路（如CDK6）促进转移。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序和流式细胞术显示ICAM1在肺转移中高表达；体外聚集实验、共免疫沉淀和结构建模证明同亲和性相互作用；体内外实验显示ICAM1敲低或抗体阻断抑制CTC簇形成、跨内皮迁移和肺转移。
- 研究意义
- 研究提出ICAM1可作为三阴性乳腺癌转移起始的新型治疗靶点，为开发靶向CTC簇和转移的疗法提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ICAM1在转移中的表达和功能
确认ICAM1在肺转移中的高表达，并评估其对肿瘤发生和转移的影响
通过流式细胞术和免疫组化检测ICAM1表达；通过过表达或敲低ICAM1，观察对原发肿瘤生长和肺转移的影响。
研究ICAM1对CTC簇形成的作用
确定ICAM1是否通过细胞聚集促进CTC簇形成
通过体外聚集实验观察ICAM1+和ICAM1-细胞的聚集效率，以及敲低ICAM1对聚集的影响。
验证ICAM1同亲和性相互作用
证明ICAM1通过同亲和性相互作用介导细胞聚集
使用固相亲和性实验、共免疫沉淀和结构建模验证ICAM1-ICAM1相互作用，并通过突变分析确定关键区域。
分析ICAM1的下游信号通路
鉴定ICAM1调控的分子通路和下游靶点
通过RNA测序和质谱分析比较ICAM1敲低细胞的转录组和蛋白质组，并通过免疫印迹验证候选蛋白。
评估ICAM1在跨内皮迁移中的作用
确定ICAM1是否促进肿瘤细胞跨内皮迁移
使用HUVEC包被的Transwell实验，评估ICAM1敲低或抗体阻断对肿瘤细胞迁移的影响。
评估体内治疗效果
验证抗ICAM1中和抗体对肺转移的抑制作用
通过尾静脉注射和原位移植模型，评估抗体对早期播种、CTC数量和自发肺转移的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| HuMEC培养基 | Life Technologies | -- | |
| I型胶原蛋白 | BD Biosciences | -- | |
| 转染 | Dharmacon siRNA | Dharmacon | -- |
| Dharmafect转染试剂 | Dharmacon | -- | |
| PolyJet转染试剂 | SignaGen Laboratories | -- | |
| ICAM1 cDNA ORF克隆，人，C-Flag标签 | Sino Biological | HG10346-CF | |
| ICAM-1 cDNA ORF克隆，人，C-Myc标签 | Sino Biological | HG10346-CM | |
| 单细胞RNA测序 | SMART-Seq™ V3 UltraTM低起始量RNA测序试剂盒 | Clontech | -- |
| Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| 测序 | HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- |
| HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- | |
| RNA测序 | TruSeq总RNA测序文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| 流式分析 | 抗人ICAM1-APC抗体 | BD Biosciences | 559771 |
| 抗ICAM1抗体（PE偶联） | BD Biosciences | 555511 | |
| FACS LSR流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞分选 | BDAria细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 细胞培养 | CellSave保存管 | -- | -- |
| 血液处理 | 裂解缓冲液 | Sigma-Aldrich | R7757 |
| CD45去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| ICAM1抗体 | Sigma-Aldrich | HPA004877 | |
| CDK6抗体 | Protein Tech | 14052-1-AP | |
| CD44抗体 | Thermo Fisher | 156-3C11 | |
| EpCAM抗体 | Thermo Fisher | MA1-10195 | |
| Oct3/4抗体 | Santa Cruz | sc-5279 | |
| c-Myc抗体 | Thermo Fisher | 13-2500 | |
| Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| Sec23a抗体 | Thermo Fisher | PA5-28984 | |
| HIF1a抗体 | Thermo Fisher | MA1-516 | |
| BMP4抗体 | Protein Tech | 12492-1-AP | |
| HMGA2抗体 | Protein Tech | 20795-1-AP | |
| CD34抗体 | Protein Tech | 14486-1-AP | |
| N-钙粘蛋白抗体 | Protein Tech | 22018-1-AP | |
| PAWR抗体 | Protein Tech | 20688-1-AP | |
| PAI1抗体 | Protein Tech | 13801-1-AP | |
| KRT19抗体 | Protein Tech | 10712-1-AP | |
| MCM3抗体 | Protein Tech | 15597-1-AP | |
| ANKRD1抗体 | Protein Tech | 11427-1-AP | |
| Notch1抗体 | Cell Signaling Technology | 3608S | |
| β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8224 | |
| ECL2化学发光液 | Thermo Fisher Scientific | 1896433A | |
| 免疫组织化学 | Decloaker抗原修复液 | Biocare Medical | RD913L |
| Dako envision plus试剂盒 | Dako | -- | |
| 免疫荧光 | Cell-Tak细胞粘附剂 | Corning | -- |
| Alexa 568偶联二抗 | Thermo Fisher | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 细胞聚集实验 | 多聚羟乙基甲基丙烯酸酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| IncuCyte活细胞成像系统 | Essen BioScience | -- | |
| 抗ICAM1中和抗体 | R&D Systems | AF720 | |
| 免疫沉淀 | Pierce免疫沉淀裂解缓冲液 | Thermo Fisher | -- |
| 抗Flag磁珠 | -- | -- | |
| 固相结合实验 | ICAM1胞外域蛋白 | Sino Biological | -- |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 | Thermo Scientific | -- | |
| 质谱分析 | LysC/胰蛋白酶 | -- | -- |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 乳腺球实验 | PRIME-XV®肿瘤球无血清培养基 | Irvine Scientific | 91130 |
| 跨内皮迁移 | 纤连蛋白 | -- | -- |
| EBM2培养基 | -- | -- | |
| 台盼蓝 | -- | -- | |
| 体外实验 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-218 |
| 动物实验 | IVIS® Spectrum成像系统 | PerkinElmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA测序 | 细胞分选标准（L2G/L2T表达）、测序平台和数据分析方法 阅读提示：Methods: Cell preparation for single-cellRNA sequencing; Single-cell RNA sequencing analysis |
| 细胞培养和转染 | 细胞系来源、培养条件、siRNA浓度和转染试剂 阅读提示：Methods: Cell lines and transfections |
| 流式细胞术和细胞分选 | 抗体、染色条件和仪器设置 阅读提示：Methods: Flow cytometry and cell sorting |
| 细胞聚集实验 | 细胞类型、培养板处理、成像时间点 阅读提示：Methods: Cell clustering assay |
| 共免疫沉淀 | 细胞处理、裂解缓冲液、抗体和洗涤条件 阅读提示：Methods: Co-immunoprecipitation |
| 体内转移模型 | 小鼠品系、细胞接种方式、剂量和治疗方案 阅读提示：Methods: Animal studies and TNBC PDX models; Results: ICAM1 is a therapeutic target in TNBC metastasis in vivo |
| 跨内皮迁移实验 | HUVEC培养、Transwell处理、肿瘤细胞数量、迁移时间 阅读提示：Methods: Transendothelial migration |
| 抗ICAM1中和抗体治疗 | 抗体剂量、给药途径、时间点 阅读提示：Methods: Statistical analysis; Results: ICAM1 is a therapeutic target in TNBC metastasis in vivo |