细胞实验验证抗坏血酸对PCSK9和LDLR表达的影响
检测抗坏血酸是否能调节肝细胞中PCSK9和LDLR的表达及LDL摄取
用不同浓度和时间处理HepG2、Huh7细胞和原代肝细胞，检测PCSK9和LDLR蛋白及mRNA水平，并评估Dil-LDL摄取。
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抗坏血酸通过抑制前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9 表达增强低密度脂蛋白受体表达
Ascorbic acid enhances low-density lipoprotein receptor expression by suppressing proprotein convertase subtilisin/kexin 9 expression.
实验完整度
高包含细胞实验、原代肝细胞、小鼠体内模型及人血清样本相关分析，并通过siRNA、启动子报告基因等方法验证机制。
主要模型
HepG2细胞 Huh7细胞 小鼠原代肝细胞 C57BL/6J小鼠 Gulo−/−小鼠 人血清样本
重点核对
抗坏血酸处理浓度和时间 FoxO3a siRNA敲低效率 启动子报告基因实验中的突变位点 小鼠品系及饮食条件 人血清样本量及检测指标
摘要
抗坏血酸是一种水溶性抗氧化剂，调节多种生物过程，并被认为影响胆固醇。然而，关于抗坏血酸介导的胆固醇代谢机制知之甚少。在这里，我们确定了抗坏血酸是否可以调节前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9 (PCSK9) 的表达，该蛋白结合低密度脂蛋白受体 (LDLR) 导致其细胞内降解，从而影响低密度脂蛋白 (LDL) 代谢。在细胞水平上，抗坏血酸抑制了 HepG2 和 Huh7 细胞系中 PCSK9 的表达。因此，LDLR 表达和细胞 LDL 摄取增强。在小鼠原代肝细胞中观察到抗坏血酸对 PCSK9 和 LDLR 表达的类似作用。机制上，抗坏血酸以叉头盒 O3 依赖性方式抑制 PCSK9 表达。此外，抗坏血酸通过调节甾醇调节元件结合蛋白 2 增加 LDLR 转录。在体内，给予抗坏血酸降低了 C57BL/6J 小鼠血清 PCSK9 水平并增强肝脏 LDLR 表达。相反，缺乏抗坏血酸补充的 L-古洛糖酸-γ-内酯氧化酶缺陷 (Gulo−/−) 小鼠循环 PCSK9 和 LDL 水平升高，肝脏 LDLR 表达降低，而抗坏血酸补充降低了 PCSK9 并增加了 LDLR 表达，改善了饲喂高脂饮食的 Gulo−/− 小鼠的 LDL 水平。此外，在人类血清样本中，抗坏血酸水平与 PCSK9、总胆固醇和 LDL 水平呈负相关。综上所述，这些发现表明抗坏血酸降低 PCSK9 表达，导致 LDLR 表达和细胞 LDL 摄取增加。因此，补充抗坏血酸可能改善抗坏血酸缺乏物种的脂质谱。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 抗坏血酸是否通过调节PCSK9和LDLR表达影响LDL代谢，其分子机制是什么？
- 核心机制
- 抗坏血酸通过激活FoxO3a抑制PCSK9转录，并通过激活SREBP2增强LDLR转录，同时增加LDLR mRNA稳定性。
- 主要证据
- 在HepG2、Huh7细胞和小鼠原代肝细胞中，抗坏血酸下调PCSK9并上调LDLR；在C57BL/6J和Gulo−/−小鼠中验证了体内效果；人血清样本显示抗坏血酸与PCSK9和LDL负相关。
- 研究意义
- 补充抗坏血酸可能改善无法内源性合成抗坏血酸的物种的脂质谱。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
机制探究：FoxO3a和SREBP2的作用
探究抗坏血酸抑制PCSK9和增强LDLR表达的分子机制是否涉及FoxO3a和SREBP2
使用siRNA敲低FoxO3a或SREBP2，检测PCSK9和LDLR表达；使用启动子荧光素酶报告基因检测PCSK9和LDLR启动子活性，并检测mRNA稳定性。
体内实验验证抗坏血酸对小鼠肝脏和血清的影响
验证抗坏血酸对小鼠肝脏PCSK9/LDLR表达及血清脂质的影响
C57BL/6J小鼠注射抗坏血酸或生理盐水1周，Gulo−/−小鼠缺乏或补充抗坏血酸，检测肝脏蛋白和mRNA表达、血清PCSK9及脂质水平。
人血清样本相关性分析
探究人血清抗坏血酸水平与PCSK9及胆固醇水平的相关性
收集24名志愿者血清，检测抗坏血酸、PCSK9、总胆固醇和LDL水平，并进行相关性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| Western blot | 兔抗PCSK9抗体 | Proteintech | 55206-1-AP |
| 兔抗LDLR抗体 | Proteintech | 10785-1-AP | |
| 兔抗SREBP2抗体 | Proteintech | 14508-1-AP | |
| 兔抗PPARγ抗体 | Proteintech | 16643-1-AP | |
| 兔抗FoxO3a抗体 | Proteintech | 10849-1-AP | |
| 兔抗HSP90抗体 | Proteintech | 13171-1-AP | |
| 免疫荧光 | FITC标记的山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00003-2 |
| Western blot | 兔抗Lamin A/C抗体 | Abclonal | A0249 |
| 兔抗磷酸化FoxO3a抗体 | Abclonal | AP0351 | |
| 兔抗β-actin抗体 | Abclonal | AC026 | |
| 小鼠抗GAPDH单克隆抗体 | Abclonal | AC033 | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Sungene Biotech | LK2001 | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP | Sungene Biotech | LK2003 | |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | -- | |
| ELISA | 小鼠PCSK9 ELISA试剂盒 | Sino Biological | SEK50251 |
| 人PCSK9 ELISA试剂盒 | Sino Biological | SEK10594 | |
| LDL摄取实验 | Dil-LDL复合物 | Yeasen | 20614ES76 |
| 抗坏血酸检测 | 抗坏血酸检测试剂盒 | Leagene Biotechnology | TC2033 |
| 细胞转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| qRT-PCR | Total RNApure试剂 | Zomanbio | -- |
| 逆转录试剂盒 | Vazyme | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | -- | -- | |
| 核质蛋白提取 | 核质蛋白提取试剂盒 | Keygen Biotech | -- |
| 启动子构建 | TransStartFastPfu DNA聚合酶试剂盒 | TransGen Biotech | -- |
| 荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| LDL摄取实验 | 玻底细胞培养皿 | Corning | -- |
| 免疫荧光 | Vectashield封片剂 | -- | -- |
| DAPI溶液 | -- | -- | |
| 动物实验 | 自动生化分析仪 | Hitachi High-Technologies Corporation | 3100 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和处理 | 细胞系来源（ATCC），培养基成分，培养条件（37°C, 5% CO2），抗坏血酸浓度（0-80 μM）和处理时间（0-24小时） 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture, 图1和图2的图注 |
| Western blot和qRT-PCR | 抗体稀释比例，蛋白上样量，PCR引物序列，内参基因（GAPDH） 阅读提示：Materials and Methods: Western blotting and qRT-PCR, 表1 |
| LDL摄取实验 | Dil-LDL浓度（20 μg/ml），孵育时间（4小时），细胞密度（1×10^5） 阅读提示：Materials and Methods: LDL uptake assay |
| siRNA转染 | siRNA序列，浓度（25 nM），转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX），转染时间（48小时） 阅读提示：Materials and Methods: siRNA transfection |
| 启动子报告基因 | 启动子构建，突变位点，转染细胞类型（293T），检测方法 阅读提示：Materials and Methods: Luciferase reporter assay, 表2 |
| 动物实验 | 小鼠品系（C57BL/6J和Gulo−/−），性别（雄性），年龄（约8周），饮食（正常或HFD），抗坏血酸给药剂量（100 mg/kg/天）和途径（腹腔注射），持续时间（1-3周） 阅读提示：Materials and Methods: In vivo study, 图5和图6图注 |
| 人血清样本 | 志愿者人数（24），年龄范围（28-58岁），伦理审批，检测指标（CHO, LDL, PCSK9, 抗坏血酸） 阅读提示：Materials and Methods: Human serum samples |