临床样本和动物模型中IGFBP7表达分析
确定IGFBP7在肾纤维化中的表达变化及其与疾病严重程度的相关性
通过单细胞测序数据、免疫组化、ELISA等方法检测IGFBP7在人类CKD患者和小鼠肾纤维化模型（UUO、IRI、CIS、AA）中的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肾小管上皮IGFBP7与PKM2相互作用驱动肾脂质蓄积和纤维化
Renal tubular epithelial IGFBP7 interacts with PKM2 to drive renal lipid accumulation and fibrosis
实验完整度
高包含体内基因敲除/过表达小鼠模型、体外细胞实验、类器官模型、LC-MS/MS、Co-IP、SPR、药物筛选及体内药效验证等多个独立证据层级，并进行了机制验证。
主要模型
HK2细胞 mTEC细胞 IGFBP7-KO小鼠 IGFBP7-cKO小鼠 IGFBP7-Tg小鼠 小鼠肾类器官 人肾类器官 CKD患者样本
重点核对
HK2细胞经HR-3C（9小时缺氧/3小时复氧循环3次）处理 小鼠模型：UUO（7天）、IRI（14天）、顺铂（10 mg/kg每周一次，共4周）、马兜铃酸（3.5 mg/kg连续4天） PKM2抑制剂紫草素给药剂量：5 mg/kg/天，隔天腹腔注射 沙美特罗给药剂量：0.1、0.3、1 mg/kg，隔天给药 IGFBP7-KO小鼠通过CRISPR-Cas9生成，cKO通过KspCre小鼠交配获得
摘要
肾纤维化是驱动慢性肾脏病（CKD）进展的关键病理机制。然而，参与该过程的发病机制和治疗靶点仍不清楚。有趣的是，我们目前发现IGFBP7在人类患者和动物模型的纤维化肾脏的肾小管上皮细胞（TECs）中高表达。然而，它们在异常肾脏修复和肾纤维化中的功能作用仍不清楚。在此，我们报道IGFBP7敲除（KO）或TEC条件性敲除（cKO）在多种小鼠模型中减轻了肾纤维化，而IGFBP7敲入或在IGFBP7-KO小鼠中恢复表达则增强了肾纤维化。这些体内发现通过培养的TECs和由IGFBP7-cKO小鼠生成的类器官得到了验证。机制上，我们发现IGFBP7与丙酮酸激酶M2（PKM2）结合，促进PKM2在K433位点的乙酰化，从而增强PKM2二聚化和核转位，随后通过SREBP1依赖性机制加速脂质生成和肾纤维化。值得注意的是，通过药物筛选，我们确定了沙美特罗（一种哮喘药物）作为IGFBP7拮抗剂，可有效减少纤维化。我们的发现揭示了IGFBP7/PKM2/SREBP1轴作为脂肪生成性纤维化的中心调节因子，提供了IGFBP7的遗传和药理学抑制作为CKD的有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IGFBP7在肾纤维化中的功能作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- IGFBP7与PKM2结合，促进PKM2 K433位点乙酰化，增强其二聚化和核转位，进而与SREBP1相互作用并抑制其泛素化降解，激活SREBP1介导的脂质生成，最终驱动肾纤维化。
- 主要证据
- IGFBP7 KO/cKO小鼠减轻多种肾纤维化模型中的纤维化，Tg小鼠加重；IGFBP7与PKM2结合（Co-IP、SPR、分子对接）；PKM2 K433R突变或PKM2敲低抑制纤维化；RNA-seq显示PKM2敲低下调脂质生成基因；沙美特罗作为IGFBP7拮抗剂在体内外减轻纤维化。
- 研究意义
- 揭示IGFBP7/PKM2/SREBP1轴作为脂肪生成性纤维化的中心调节因子，提供IGFBP7的遗传和药理学抑制作为CKD的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
IGFBP7基因敲除和过表达对肾纤维化的影响
验证IGFBP7在肾纤维化中的因果作用
利用IGFBP7-KO、cKO和Tg小鼠，结合UUO、IRI、CIS和AA模型，评估纤维化程度。
体外TECs间质表型模型建立及IGFBP7功能验证
验证IGFBP7在体外直接诱导TECs间质表型
使用HR-3C和顺铂处理HK2和mTEC细胞，过表达或敲低IGFBP7，检测间质标志物（COL-1、αSMA）表达。
类器官模型验证IGFBP7功能
在三维类器官模型中验证IGFBP7对纤维化的影响
从IGFBP7-cKO小鼠和人类肾脏制备类器官，经HR-3C处理，检测间质标志物。
IGFBP7与PKM2相互作用及机制研究
阐明IGFBP7与PKM2的结合及其对PKM2修饰和定位的影响
通过LC-MS/MS鉴定IGFBP7相互作用蛋白，Co-IP、SPR、分子对接验证结合，检测PKM2乙酰化、二聚化和核转位。
PKM2功能验证（体内外）
验证PKM2在IGFBP7介导的肾纤维化中的作用
使用PKM2抑制剂shikonin和siRNA敲低PKM2，在体内外检测纤维化表型。
脂质代谢与SREBP1通路研究
阐明IGFBP7/PKM2通过SREBP1促进脂质积累的机制
通过油红O染色、BODIPY荧光、RNA-seq检测脂质生成基因，Co-IP检测PKM2与SREBP1相互作用，泛素化实验分析SREBP1稳定性。
药物筛选及沙美特罗验证
鉴定靶向IGFBP7的抗纤维化药物
通过虚拟筛选和实验验证，确定沙美特罗为IGFBP7拮抗剂，并在体内外评估其抗纤维化效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白检测 | 抗COL-1抗体 | Proteintech | 66761-1-Ig |
| 抗αSMA抗体 | Proteintech | 14395-1-AP | |
| 抗PKM2抗体 | Proteintech | 15822-1-AP | |
| 抗乙酰赖氨酸抗体 | Zen-Bio | 502391 | |
| 抗SIRT6抗体 | Proteintech | 13572-1-AP | |
| 抗SREBP1抗体 | Proteintech | 14088-1-AP | |
| 抗IGFBP7抗体 | Abcam | ab171085 | |
| 抗IGFBP7抗体 | Proteintech | 19961-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Servicebio | bs-10966R | |
| 抗lamin B抗体 | Wanlei | WL01775 | |
| 免疫荧光 | 荧光标记的LTL | Vector Laboratories | FL-1321 |
| 荧光标记的PNA | Vector Laboratories | FL-1071 | |
| 荧光标记的DBA | Vector Laboratories | FL-1031 | |
| Western blot | IRDye-800偶联二抗 | Rockland Immunochemicals | -- |
| 组织学染色 | PAS染色试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 肾功能检测 | 肌酐测定试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 血尿素氮测定试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| ELISA | IGFBP7 ELISA试剂盒 | Shanghai MLBIO Biotechnology | -- |
| 细胞处理 | 重组小鼠IGFBP7蛋白 | Novoprotein | CU51 |
| 药物处理 | 顺铂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 马兜铃酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 紫草素 | TargetMol | T1125 | |
| 昔萘酸沙美特罗 | MedChemExpress | 94749-08-3 | |
| AAV注射 | AAV包装的IGFBP7过表达质粒 | GeneChem | 1×10^12 vg/mL |
| 慢病毒注射 | 携带IGFBP7敲低质粒的慢病毒 | GenePharma | -- |
| 细胞培养 | DMEM-F12培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 类器官培养 | 基质胶 | Corning | -- |
| RNA提取 | RNeasy RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green Supermix预混液 | Bio-Rad | -- |
| 反转录试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| CETSA | 蛋白测定试剂盒 | Beyotime | -- |
| 肾小球滤过率测定 | FITC-菊粉 | -- | -- |
| Western blot成像 | Li-Cor/Odyssey红外成像系统 | LI-COR Biosciences | -- |
| 显微成像 | Olympus IX83显微镜 | Olympus | -- |
| 高内涵成像 | ImageXpress Micro 4高内涵成像系统 | Molecular Devices | -- |
| SPR | Biacore T200系统 | Cytiva | -- |
| 质谱分析 | Q Exactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PCR | CFX96 PCR仪 | Bio-Rad | -- |
| 药物筛选试剂 | 罗丹明B异硫氰酸酯 | TargetMol | 36877-69-7 |
| 脂滴染色 | 油红O染色试剂盒 | Beyotime | -- |
| BODIPY 493/503 | MedChemExpress | HY-D1614 | |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G磁珠 | Bio-linkedin | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与诱导 | HK2和mTEC细胞培养条件，HR-3C诱导周期（9h缺氧/3h复氧，循环3次），CIS浓度（6 μM）和处理时间 阅读提示：Materials and methods 中 Cell culture and treatment |
| 动物模型 | UUO（7天）、IRI（30分钟缺血）、CIS（10 mg/kg/周）、AA（3.5 mg/kg/天，4天）的具体操作和剂量，小鼠品系、周龄、性别 阅读提示：Materials and methods 中 Murine model of renal fibrosis |
| 基因敲除与过表达 | IGFBP7-KO、cKO、Tg小鼠的构建方法，AAV和慢病毒注射方式及剂量 阅读提示：Materials and methods 中 Generation and verification of IGFBP7 knockout, conditional knockout, and overexpressed transgenic mice 和 IGFBP7 restore and IGFBP7 intervention experiment |
| 药物处理 | 紫草素剂量（5 mg/kg/天，隔天）、沙美特罗剂量（0.1,0.3,1 mg/kg，隔天）、给药途径（腹腔注射） 阅读提示：Materials and methods 中 Murine model of renal fibrosis 和相关 Results 部分 |
| 蛋白相互作用检测 | Co-IP的抗体选择、SPR的蛋白浓度梯度、分子对接的软件和参数 阅读提示：Materials and methods 中 Co-immunoprecipitation、Surface plasmon resonance assay 和 Virtual screening and molecular docking |
| 脂质检测 | 油红O染色的固定和染色时间、BODIPY染色浓度和时间 阅读提示：Materials and methods 中 Lipid droplets staining |