构建dMet-TPS数据库
预测并生成替代下游AUG引导的胰蛋白酶肽序列数据库，以支持隐蔽翻译起始位点的鉴定。
从Swiss-Prot人类蛋白序列中提取预测的N端胰蛋白酶肽片段，允许一个漏切位点，生成包含差异AUG引导肽段序列的数据库。
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实时搜索辅助的多重定量蛋白质组学揭示人类癌细胞中全系统范围的隐蔽翻译起始
Real-time search-assisted multiplexed quantitative proteomics reveals system-wide cryptic translation initiation in human cancer cells
实验完整度
高包含TMT定量蛋白质组学、Western blot、免疫沉淀-质谱等多层级验证，功能验证和机制验证明确。
主要模型
患者来源胶质母细胞瘤起始细胞GB2 人宫颈癌HeLa细胞
重点核对
GB2和HeLa细胞的培养条件及EGF处理浓度（20 ng/ml）和时间（15、60 min） Torin 1处理浓度（250 nM）和时间（120 min） TMT标记及质谱鉴定的参数（如动态排除、质量容差） EGF诱导蛋白上调的显著阈值（FC>1.5，p<0.05） 统计方法（Benjamini-Hochberg校正）
摘要
背景：通常认为真核生物翻译起始主要通过核糖体从每个mRNA的5'帽端扫描，在第一个AUG密码子处发生。为了在全蛋白质组范围内鉴定由替代AUG密码子定义的隐蔽内部翻译起始位点，我们生成了一个定制的氨基酸序列数据库，其中包含根据精心整理的Swiss-Prot人类蛋白质参考序列计算预测的差异AUG引导的胰蛋白酶肽片段，并将其应用于基于高分辨率质谱的蛋白质组学分析。结果：基于Orbitrap Eclipse Tribrid质谱系统实时搜索平台的超深度蛋白质组检测不仅鉴定了超过26,000个来自已注释人类蛋白质编码序列的独特肽段，还鉴定了794个由人类癌细胞中替代下游翻译起始定义的新肽片段。非常值得注意的是，基于串联质谱标签的多重定量分析患者来源的胶质母细胞瘤起始细胞，揭示了表皮生长因子依赖的翻译调控，涉及广泛的差异AUG引导的非经典蛋白质形式以及癌症相关转录因子和细胞周期/细胞分裂调节因子，且具有细胞类型特异性。结论：我们的研究提供了人类癌细胞中下游AUG引导的隐蔽翻译起始动态的全蛋白质组范围的首次证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类癌细胞中是否存在由替代下游AUG密码子定义的隐蔽翻译起始，以及EGF-mTOR信号通路如何调控这些非经典蛋白质形式的表达？
- 核心机制
- EGF通过mTOR信号通路（可能通过RPS6磷酸化）调控下游AUG引导的隐蔽翻译起始，导致非经典蛋白质形式的翻译上调。
- 主要证据
- 基于TMT标记的定量蛋白质组学发现GB2细胞中EGF处理上调了114个已知蛋白和12个新型蛋白（>1.5倍），而Torin 1抑制了其中大部分上调；在HeLa细胞中仅上调了9个已知和2个新型蛋白。
- 研究意义
- 首次在全蛋白质组水平证明人类癌细胞中下游AUG引导的隐蔽翻译起始的存在及其调控，为理解癌症中的翻译调控提供新视角，并为评估药物扰动的翻译起始动态提供方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞培养与药物处理
评估EGF和Torin 1对GB2和HeLa细胞中蛋白质翻译的影响。
GB2和HeLa细胞在有无mTOR抑制剂Torin 1预处理后，用EGF刺激不同时间，收集细胞裂解液用于后续分析。
TMT标记和质谱分析
对EGF处理的细胞进行定量蛋白质组学分析，以鉴定和量化蛋白质表达变化。
细胞裂解液经还原、烷基化、酶解后，用TMTpro标记，混合后进行LC-MS/MS分析，使用实时搜索（RTS）辅助的Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪，使用dMet-TPS数据库和Swiss-Prot数据库进行鉴定和定量。
Western blot验证
验证EGF和Torin 1处理对RPS6磷酸化的影响。
对GB2和HeLa细胞进行Western blot分析，检测RPS6磷酸化水平，以β-Actin为内参。
免疫沉淀-质谱分析
分析EGF处理后γ-烯醇化酶蛋白复合物的组成变化。
使用抗γ-烯醇化酶抗体进行免疫沉淀，然后进行质谱分析，以定量不同AUG导向的蛋白质形式。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Pierce | -- |
| B27补充剂（不含维生素A） | -- | -- | |
| 药物处理 | 表皮生长因子 | Wako | -- |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Wako | -- | |
| Torin 1 | Cayman Chemical | -- | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TMT标记 | TMTpro 16plex标记试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白消化 | 赖氨酰内肽酶 | FUJIFILM Wako Chemicals | -- |
| 胰蛋白酶（Gold级） | Promega | -- | |
| 样品脱盐 | ZipTip C18 脱盐吸头 | Millipore | -- |
| Western blot | 抗磷酸化S6核糖体蛋白 (Ser235/236) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4858 |
| 抗S6核糖体蛋白 (5G10) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| 抗β-肌动蛋白 (13E5) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 免疫沉淀 | 抗烯醇化酶-2 (D20H2) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 8171 |
| Western blot | 抗兔IgG HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 |
| 免疫沉淀 | Protein A磁珠 | Cell Signaling Technology | 73778 |
| 细胞裂解 | 10×细胞裂解缓冲液 | Cell Signaling Technology | 9803 |
| Western blot | Luminata Forte Western HRP底物 | Merck KGaA | -- |
| Western blot成像 | iBright FL1500成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FAIMS Pro接口 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 液相色谱 | Vanquish Neo超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 样品处理 | Benzonase核酸酶 | Novagen | -- |
| 数据库构建 | Swiss-Prot人类蛋白质数据库 | -- | -- |
| 质谱数据分析 | Proteome Discoverer软件 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与药物处理 | GB2和HeLa细胞的培养条件、EGF浓度（20 ng/ml）、处理时间（15、60 min）、Torin 1浓度（250 nM）及预处理时间（120 min） 阅读提示：Methods: Cell culture and drug perturbation |
| TMT标记与质谱分析 | TMTpro标记、酶解条件（LysC和Trypsin）、质谱参数（质量容差、动态排除等）以及数据库搜索参数 阅读提示：Methods: TMT Labeling, LC–MS/MS analysis |
| Western blot | 抗体信息、处理条件、成像系统 阅读提示：Methods: Western blotting analysis |
| 免疫沉淀-质谱分析 | EGF处理时间、IP抗体、洗涤条件、质谱定量方法（LFQ） 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation-mass spectrometry (IP-MS) analysis |