An armed oncolytic virus enhances the efficacy of tumor-infiltrating lymphocyte therapy by converting tumors to artificial antigen-presenting cells in situ
包含体外共培养、PDX模型、同系小鼠模型、免疫细胞耗竭、细胞因子分析及单细胞测序等多个证据层级，并进行了功能验证和机制探索。
人原代口腔癌细胞与匹配的自体TIL共培养体系 口腔癌PDX小鼠模型（OC1、OC4） MC38结直肠癌同系小鼠模型 Pan02-HVEM胰腺癌同系小鼠模型
OV-OX40L/IL12的构建及表达验证（OX40L表面表达、IL12分泌） 肿瘤细胞感染OV后aAPC表型变化（MHC I/II、CD80/CD86、PD-L1） TIL与OV感染肿瘤细胞共培养后的活化（IFN-γ ELISpot/ELISA）和杀伤效果（MTT） 联合疗法在PDX和同系小鼠模型中的抑瘤效果及生存期 免疫细胞耗竭实验（CD8、CD4、NK）验证CD8+ T细胞的关键作用
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建能够感染肿瘤细胞并表达功能性OX40L和IL12的HSV-1溶瘤病毒，以提供T细胞活化所需的共刺激信号和细胞因子。
基于ICP34.5和ICP47双缺失的HSV-1骨架，构建表达三聚体OX40L和IL12的重组病毒（OV-OX40L/IL12）及单表达或GFP对照病毒。在SCC-15等肿瘤细胞中感染后，通过流式细胞术检测OX40L表面表达，用OX40报告细胞和IL12荧光素酶报告细胞验证其功能活性，并用ELISA检测IL12分泌。
评估OV感染的肿瘤细胞是否呈现aAPC表型，并增强自体TIL的活化、增殖和杀伤能力。
将原代口腔癌细胞与自体TIL共培养，使用RT-PCR和流式细胞术检测APC相关分子（HLA-A/B/C、HLA-DR/DP/DQ、CD80、CD86、PD-L1）表达；通过细胞计数、IFN-γ ELISpot和ELISA检测TIL活化；MTT法评估TIL的细胞毒性；并对共培养的TIL进行scTCR-seq和scRNA-seq分析TCR组库和转录组。
在患者来源异种移植（PDX）模型中测试OV-OX40L/IL12与自体TIL联合治疗的抗肿瘤效果。
免疫缺陷NSG小鼠皮下接种患者肿瘤组织（OC1和OC4 PDX模型），待肿瘤生长至200–300 mm3时，瘤内注射单剂量OV（2×105 PFU），2天后瘤内注射自体TIL（2×106），隔天腹腔注射IL2（10 μg），监测肿瘤生长、生存期，并进行免疫组化和瘤内IFN-γ水平检测。
在免疫功能正常的小鼠模型中验证联合疗法的系统性抗肿瘤效应和长期免疫记忆的建立。
建立MC38结直肠癌和Pan02-HVEM胰腺癌同系小鼠模型，待肿瘤体积约50 mm3时，瘤内注射OV-mOX40L/IL12两次（每次2×106 PFU），第二次注射后2天瘤内注射TIL（106/只），监测肿瘤生长和生存期；进行双侧肿瘤模型评估远端效应；对治愈小鼠进行肿瘤再挑战实验评估免疫记忆；进行抗体介导的CD4、CD8、NK细胞耗竭实验；并通过流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞表型、血清细胞因子谱。
阐明联合疗法对肿瘤微环境中免疫细胞组成和功能状态的影响。
通过流式细胞术分析MC38和Pan02-HVEM肿瘤模型中肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞（包括T细胞、NK细胞、巨噬细胞、DC）的活化状态和表型，使用Bio-Plex系统检测血清细胞因子水平，并通过OT-I/OT-II细胞共培养实验评估肿瘤细胞对初始T细胞的激活能力。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒构建 | HiScreen Capto Core 700 | GE Healthcare | 17-5481-15 |
| 病毒纯化 | 超滤管 | Millipore | UFC910096 |
| 病毒检测 | Vero细胞宿主蛋白ELISA试剂盒 | Cygnus | F500 |
| TIL制备 | 胶原酶 | Sigma | C5138 |
| 透明质酸酶 | Sigma | H2126 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma | D5025 | |
| 细胞筛网 | Falcon | 352350 | |
| 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 | |
| TIL培养 | 重组人IL2 | PeproTech | AF-200-02-10 |
| 重组人IL7 | PeproTech | AF-200-07-10 | |
| 重组人IL15 | PeproTech | AF-200-07-10 | |
| OKT-3抗体 | Acro | CDE-M120a | |
| TIL快速扩增 | AIM V培养基 | Invitrogen | 12055083 |
| 药物处理 | 地西他滨 | Solarbio | D9010 |
| 细胞因子处理 | 重组人IFN-γ | ACRO | IFG-H4211 |
| 重组人TNF-α | ACRO | TNA-H4211 | |
| T细胞分离 | CD45磁珠 | MACS | 130-118-780 |
| MTT实验 | MTT溶液 | Beyotime | ST316 |
| 二甲基亚砜 | Solarbio | D8371 | |
| 细胞活力检测 | alamarBlue细胞活力检测试剂 | Solarbio | A7631 |
| 酶标仪 | MD | SpectraMax | |
| 共培养实验 | L-谷氨酰胺 | Solarbio | G0200 |
| ELISA检测 | IFN-γ ELISA试剂盒 | R&D Systems | VAL104 |
| ELISpot实验 | IFN-γ预包被ELISpot试剂盒 | Dakewe Biotech | -- |
| PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596018 |
| HiScript第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme Biotech | R111-01 | |
| 实时PCR | FS通用SYBR Green Master Rox | Roche | 4913850001 |
| ABI 7700序列检测系统 | Applied Biosystems | -- | |
| PDX模型建立 | Matrigel基质胶 | Biocoat | 354234 |
| T细胞分离 | 初始CD8a+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi | -- |
| 初始CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi | -- | |
| T细胞扩增 | 小鼠IL2 | Sino Biological | -- |
| Ultra-LEAF纯化抗小鼠CD3ε抗体 | BioLegend | 145-2C11 | |
| Ultra-LEAF纯化抗小鼠CD28抗体 | BioLegend | 37.51 | |
| T细胞分离 | CD8+ T细胞分离试剂盒II | Miltenyi | -- |
| IHC分析 | 柠檬酸钠抗原修复液 | Beyotime | -- |
| 山羊血清 | Solarbio | -- | |
| 兔抗IFN-γ多克隆抗体 | Bioss | -- | |
| 兔抗HLA-A/B/C多克隆抗体 | Bioss | -- | |
| 兔抗HLA-DR单克隆抗体 | Bioss | -- | |
| 兔抗CD134多克隆抗体 | Bioss | -- | |
| 兔抗CD137多克隆抗体 | Bioss | -- | |
| 兔抗CD86多克隆抗体 | Bioss | -- | |
| 山羊抗兔二抗 | ZSGB-Bio | -- | |
| 流式细胞术 | TruStain FcX（抗小鼠CD16/32） | BioLegend | 101320 |
| 血清细胞因子分析 | Bio-Plex Pro小鼠细胞因子23重检测试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| 免疫细胞耗竭 | InVivoMab抗小鼠CD4抗体 | Bio X Cell | -- |
| InVivoMab抗小鼠CD8α抗体 | Bio X Cell | -- | |
| InVivoMab抗小鼠NK1.1抗体 | Bio X Cell | -- | |
| 检测HVEM表达 | 抗HVEM抗体 | R&D Systems | MAB356 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒构建与表达验证 | 病毒构建方法、OX40L/IL12表达框设计、感染MOI、报告细胞系统 阅读提示：Materials and methods: OV modification; Figures 1C-1F |
| 体外共培养 | 肿瘤细胞类型（原代口腔癌细胞）、TIL共培养比例、OV感染MOI、共培养时间、检测指标（IFN-γ、细胞毒性） 阅读提示：Results: OV-OX40L/IL12 transformed tumor cells...; Materials and methods: Tumor cell and TIL coculture assay; Figure 2 |
| PDX模型 | NSG小鼠、肿瘤接种方法（皮下）、OV和TIL的剂量、给药途径（瘤内）、IL2支持方案、肿瘤体积测量频率 阅读提示：Materials and methods: Establishment of the PDX model; Figure 3 |
| 同系小鼠模型 | C57BL/6J小鼠、MC38/Pan02-HVEM细胞植入数量、OV和TIL的剂量和给药时间、再挑战实验方案、耗竭抗体种类和剂量 阅读提示：Materials and methods: Syngeneic tumor mouse models; Figure 4 |
| 免疫细胞分析 | 处理时间点（第3天、第7天）、流式抗体panel、细胞因子检测方法（Bio-Plex） 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry analysis; Serum cytokine profile; Figure 5-6 |
