筛选调控survivin的DUB
利用CRISPR-Cas9 DUB敲除文库筛选影响survivin蛋白水平的去泛素化酶。
将靶向USP家族成员的sgRNA与Cas9共转染至HCT116细胞，通过嘌呤霉素筛选后裂解细胞，用Western blot检测survivin蛋白水平。
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去泛素化酶USP19通过稳定survivin调控有丝分裂进程和肿瘤发生的双重作用
Dual role of deubiquitinating enzyme USP19 regulates mitotic progression and tumorigenesis by stabilizing survivin
实验完整度
高包含CRISPR-Cas9筛选、体外细胞实验、活细胞成像、动物异种移植瘤模型及临床组织样本验证，功能与机制验证完整。
主要模型
HCT116细胞系 SW480、SW620、HT29细胞系 NSG小鼠异种移植瘤模型 人乳腺癌和结肠癌组织芯片
重点核对
CRISPR-Cas9介导的USP19敲除细胞系的构建及验证 USP19与survivin的相互作用及去泛素化活性 USP19缺失对有丝分裂和胞质分裂的影响 USP19缺失对细胞凋亡和肿瘤生长的影响
摘要
Survivin是染色体乘客复合物的一个组分，该复合物包括Aurora B、INCENP和Borealin，是染色体分离和胞质分裂所必需的。我们对去泛素化酶进行了全基因组筛选以寻找survivin的调节因子。我们首次报道USP19通过调节survivin表达在有丝分裂和肿瘤发生中具有双重作用。我们的结果发现，在HCT116细胞中USP19稳定并与survivin相互作用。USP19使survivin蛋白去泛素化并延长其半衰期。我们还发现USP19通过控制survivin蛋白的下游信号传导而发挥有丝分裂调节因子的作用。靶向基因组敲除验证了USP19缺失导致多种有丝分裂缺陷，包括胞质分裂失败。此外，USP19缺失导致凋亡显著富集，并减少小鼠异种移植瘤的生长。我们设想在肿瘤药物开发中同时靶向USP19和survivin将增加治疗价值并减少冗余。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在系统筛选调控survivin蛋白的去泛素化酶，并探究其在有丝分裂和肿瘤发生中的作用。
- 核心机制
- USP19作为去泛素化酶，通过去泛素化稳定survivin蛋白，防止其经泛素-蛋白酶体途径降解，从而维持survivin水平，进而调控下游信号（如磷酸化组蛋白H3）和有丝分裂进程。
- 主要证据
- 通过CRISPR-Cas9 DUB敲除文库筛选发现USP19敲低降低survivin蛋白水平；免疫共沉淀证实二者相互作用；去泛素化实验和半衰期分析表明USP19延长survivin半衰期；USP19敲除导致有丝分裂缺陷、胞质分裂失败、凋亡增加和肿瘤生长抑制；survivin回补可逆转这些表型。
- 研究意义
- 作者提出同时靶向survivin及其稳定因子USP19可能增强抗癌治疗效果，为癌症治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证USP19对survivin的调控
验证USP19是否通过去泛素化稳定survivin蛋白。
在HCT116细胞中过表达或敲除USP19，检测survivin蛋白水平、相互作用、去泛素化状态和半衰期。
评估USP19在有丝分裂中的作用
探究USP19缺失对细胞有丝分裂进程的影响。
通过活细胞成像和免疫荧光观察USP19敲除细胞的有丝分裂表型，包括染色体排列、胞质分裂和纺锤体形态。
检测USP19对细胞凋亡和肿瘤发生的影响
评估USP19缺失对细胞凋亡和肿瘤生长的影响。
通过流式细胞术检测凋亡，通过体外功能实验（细胞活力、集落形成、迁移、侵袭）和体内异种移植瘤模型观察肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Gibco BRL | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| DPSCBM培养基 | Lonza | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | -- |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | -- | |
| 质粒构建 | pEGFP-N1 GFP-H2B质粒 | Addgene | 11680 |
| pRK-FLAG-USP19质粒 | Addgene | 78597 | |
| pRK5-FLAG-USP19C506A质粒 | Addgene | 36307 | |
| pcDNA-HA-ubiquitin质粒 | Addgene | 18712 | |
| CRISPR筛选 | Cas9-2a-mRFP-2a-PAC质粒 | Toolgen | -- |
| pRG2质粒 | Toolgen | -- | |
| CRISPR敲除 | T7核酸内切酶1 | New England Biolabs | -- |
| 核酸提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Favorgen | -- |
| 逆转录 | SuperScript III第一链合成系统 | Life Technologies | -- |
| qPCR | Fast SYBR Green预混液 | Life Technologies | -- |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR仪 | Life Technologies | -- | |
| 免疫沉淀 | Protein A/G Plus琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 |
| 蛋白酶体抑制 | MG132 | Selleckchem | S2619 |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | Invitrogen | 12122530 |
| 免疫荧光 | DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
| VectaShield封片剂 | Vector Laboratories | -- | |
| TUBE检测 | TUBEs检测试剂盒 | LifeSensors | -- |
| 细胞凋亡检测 | PE annexin-V/7-AAD染色试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| 碘化丙啶 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Dojindo Molecular Technologies | -- |
| 集落形成 | 结晶紫 | -- | -- |
| Transwell侵袭 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| 免疫组化 | USP19抗体 | Proteintech | 25768-1-AP |
| Survivin抗体 | Cell Signaling Technology | 2803S | |
| 免疫印迹 | 抗FLAG抗体 | MBL Life Science | M185-3L |
| 抗磷酸化组蛋白H2AX抗体 | Merck | 05-636 | |
| 抗GFP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-996 | |
| 抗INCENP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376514 | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8017 | |
| 抗USP9X抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365353 | |
| 抗HA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7392 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 正常小鼠IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| 抗USP3抗体 | Genetex | GTX128238 | |
| 抗USP17/DUB3抗体 | Novus Biologicals | NBP1-79745 | |
| 抗Aurora B抗体 | Bethyl Laboratories | A300-431A | |
| 免疫荧光 | 抗磷酸化组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 3377 |
| 抗TPX2抗体 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
| Alexa Fluor 488偶联二抗 | Invitrogen | A21207 | |
| Alexa Fluor 594偶联二抗 | Invitrogen | A21203 | |
| 活细胞成像 | DeltaVision Core显微镜 | GE Healthcare | -- |
| Lab-Tek II腔室盖玻片 | Thermo Fisher | -- | |
| 荧光显微镜 | Leica荧光显微镜（DM5000B） | Leica | DM5000B |
| 集落计数 | IX71显微镜 | Olympus | IX71 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DUB筛选 | HCT116细胞密度、转染试剂及用量、嘌呤霉素浓度和处理时间、Western blot检测的抗体 阅读提示：Materials and methods 中 'DUBs screening using DUB KO sgRNA library' 和 Figure 1 图注 |
| 质粒转染 | 转染试剂（Lipofectamine 2000/3000）、质粒浓度、细胞密度、转染时间 阅读提示：Materials and methods 中 'Transfection' 和 'Plasmids and sgRNAs' |
| USP19敲除细胞系构建 | sgRNA序列、Cas9质粒、嘌呤霉素筛选浓度和时间、单克隆筛选流程 阅读提示：Materials and methods 中 'Generation of KO cell lines using CRISPR-Cas9' 和 Figure 3C |
| 去泛素化检测 | MG132浓度和处理时间、裂解液成分、免疫沉淀抗体量、检测抗体 阅读提示：Materials and methods 中 'Immunoprecipitation assays' 和 'Deubiquitination assay' |
| 半衰期检测 | CHX浓度、处理时间点、细胞处理方式（是否复苏、转染）、Western blot检测 阅读提示：Materials and methods 中 'Deubiquitination assay' 和 Figure 3G 图注 |
| 活细胞成像 | 细胞转染GFP-H2B、胸苷同步化处理时间和浓度、释放时间、成像间隔和时长、设备设置 阅读提示：Materials and methods 中 'Time-lapse microscopy' 和 Figure 4 图注 |
| 免疫荧光 | 细胞固定、通透化、封闭条件、一抗及二抗浓度、孵育时间、DAPI染色 阅读提示：Materials and methods 中 'Immunofluorescence' 和 Figure 4F、5A 图注 |
| 凋亡检测 | annexin-V/7-AAD染色试剂盒及用量、PI染色步骤、流式细胞仪设置及分析软件 阅读提示：Materials and methods 中 'Apoptosis assays' 和 Figure 7C-7E 图注 |
| 细胞功能实验 | CCK-8试剂浓度、孵育时间、1×10^4细胞/孔接种密度；软琼脂浓度、培养时间；划痕宽度、成像时间；Transwell小室孔径、基质胶浓度、细胞密度、孵育时间 阅读提示：Materials and methods 中 'Cell viability assay'、'Soft agar assay'、'Wound healing assay'、'Transwell invasion assay' |
| 动物实验 | NSG小鼠品系、性别、年龄（6周龄）、细胞注射数量（4.0×10^6）、注射部位（右胁腹）、分组（每组6只）、肿瘤测量频率（每5天，共25天） 阅读提示：Materials and methods 中 'Xenograft tumor experiment' 和 Figure 7J-7K 图注 |