转录组分析免疫抑制特征
分析金黄色葡萄球菌骨髓炎小鼠骨组织中免疫抑制相关基因的表达变化
对小鼠金黄色葡萄球菌骨髓炎模型和对照的股骨进行转录组测序，利用DESeq2和clusterProfiler进行差异表达基因和GO富集分析。
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PD-1/PD-L1阻断是治疗小鼠金黄色葡萄球菌骨髓炎的有效辅助手段
PD-1/PD-L1 blockade is a potent adjuvant in treatment of Staphylococcus aureus osteomyelitis in mice
实验完整度
高包含转录组分析、体外细胞实验（RAW264.7和BMDM）、体内小鼠模型（中和抗体、PD-L1敲除）、患者样本验证，并有功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠植入性金黄色葡萄球菌骨髓炎模型 RAW264.7巨噬细胞系 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） 金黄色葡萄球菌骨髓炎患者骨髓样本
重点核对
PD-1/PD-L1在感染骨髓巨噬细胞中的表达上调 阻断PD-1/PD-L1对巨噬细胞吞噬和杀菌活性的影响 PD-1/PD-L1信号对线粒体自噬和mtROS的调控 体内阻断PD-1/PD-L1联合庆大霉素对骨感染和骨破坏的改善作用 PD-L1敲除减轻金黄色葡萄球菌骨髓炎骨破坏
摘要
对于植入相关的金黄色葡萄球菌骨髓炎，目前尚无有效疗法，这是骨科手术后的破坏性并发症。基于我们的小鼠金黄色葡萄球菌骨髓炎模型的转录数据（GEO: GSE166522），我们鉴定出一种免疫抑制特征，其上调的程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡配体1（PD-1/PD-L1）表达增强。PD-1/PD-L1的表达主要在金黄色葡萄球菌感染骨中脓肿周围的F4/80+巨噬细胞中上调。在机制上，PD-1/PD-L1激活线粒体自噬以抑制线粒体活性氧（ROS）的产生，从而抑制巨噬细胞的杀菌功能。使用PD-L1或PD-1的中和抗体，或敲除PD-L1作为庆大霉素的辅助治疗，显著减少骨髓F4/80+细胞中的线粒体自噬，增强骨组织和植入物的细菌清除，并减少小鼠的骨破坏。金黄色葡萄球菌骨髓炎患者的骨髓中PD-1/PD-L1表达也增加。这些发现揭示了PD-1/PD-L1介导的线粒体自噬在抑制骨髓巨噬细胞杀菌功能中迄今未知的功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PD-1/PD-L1信号在金黄色葡萄球菌骨髓炎发病机制中的作用及其对巨噬细胞杀菌功能的调控机制是什么？
- 核心机制
- 金黄色葡萄球菌感染诱导巨噬细胞PD-1/PD-L1表达上调，激活线粒体自噬，减少线粒体ROS，从而抑制巨噬细胞的杀菌功能。
- 主要证据
- 转录组数据显示感染骨中免疫抑制特征上调；体外实验显示PD-1/PD-L1阻断或PD-L1敲除增强巨噬细胞杀菌活性，并逆转线粒体自噬及mtROS的变化；体内实验显示PD-1/PD-L1阻断或PD-L1敲除联合庆大霉素减少骨和植入物中的细菌数量并减轻骨破坏。
- 研究意义
- PD-1/PD-L1可能是金黄色葡萄球菌骨髓炎的潜在治疗靶点，阻断PD-1/PD-L1信号联合抗生素可能是治疗金黄色葡萄球菌骨髓炎的合理策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测PD-1/PD-L1在免疫细胞中的表达
确定PD-1/PD-L1在骨髓炎小鼠骨中的表达模式及主要细胞类型
通过流式细胞术检测骨髓中巨噬细胞和中性粒细胞上PD-1/PD-L1的表达，并通过免疫组化和免疫荧光观察其在骨组织中的定位。
体外验证PD-1/PD-L1对巨噬细胞功能的影响
验证金黄色葡萄球菌感染诱导PD-1/PD-L1表达，并探究其对巨噬细胞吞噬和杀菌功能的影响
用金黄色葡萄球菌感染RAW264.7和BMDM，检测PD-1/PD-L1表达；用PD-1/PD-L1中和抗体处理后，测定吞噬和杀菌能力。
机制探讨：PD-1/PD-L1调控线粒体自噬和mtROS
探究PD-1/PD-L1信号是否通过调节线粒体自噬和mtROS影响巨噬细胞杀菌功能
检测感染后BMDM中mtROS水平和线粒体自噬的变化，以及阻断PD-1/PD-L1或添加线粒体自噬抑制剂后这些指标的变化和杀菌功能。
体内验证：阻断PD-1/PD-L1对骨髓炎的影响
验证体内阻断PD-1/PD-L1信号（中和抗体或基因敲除）联合庆大霉素对细菌清除和骨破坏的影响
建立小鼠骨髓炎模型，给予抗PD-1或抗PD-L1抗体或使用PD-L1敲除小鼠，检测骨和植入物中的细菌载量、骨组织病理学和micro-CT分析。
患者样本验证
评估PD-1/PD-L1在人类金黄色葡萄球菌骨髓炎患者中的表达
通过Western blot检测患者骨髓组织中PD-1和PD-L1的蛋白水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 胰蛋白胨大豆肉汤 | -- | -- |
| 动物模型 | 三溴乙醇 | -- | -- |
| 不锈钢针 | -- | -- | |
| 庆大霉素 | -- | -- | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Epizyme | PC101 |
| 蛋白酶抑制剂 | MedChemExpress | HY-K0010 | |
| 磷酸酶抑制剂 | MedChemExpress | HY-K0023 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Immobilon P, Merck Millipore | IPVH00010 | |
| 抗PD-1抗体 | Proteintech | 18106-1-AP | |
| 抗PD-L1抗体 | Proteintech | 17952-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Huabio | ET1601-4 | |
| 山羊抗小鼠IgG HRP | Huabio | HA1006 | |
| 山羊抗兔IgG HRP | Huabio | HA1001 | |
| Western Lightning Plus 增强化学发光试剂 | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| 流式细胞术 | 70 μm细胞过滤器 | Biologix | 15-1070 |
| 红细胞裂解液 | Leagene | CS0001 | |
| 抗CD16/CD32抗体 | BioLegend | 101319 | |
| 抗F4/80-BV711 | BioLegend | 123147 | |
| 抗CD11b-BV421 | BioLegend | 101235 | |
| 抗Ly6G-PerCP | BioLegend | 127653 | |
| 抗PD-1-FITC | BioLegend | 135213 | |
| 抗PD-L1-PE | BioLegend | 124307 | |
| BD LSRII 流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| 免疫组化 | Vectastain ABC HRP试剂盒 | Vector Laboratories | AK-5000 |
| DAB显色试剂盒 | Vector Laboratories | SK4100 | |
| 免疫荧光 | 抗F4/80抗体 | Bio-Rad | MCA497G |
| Alexa Fluor 594偶联驴抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | 1796375 | |
| Dylight 488偶联山羊抗大鼠IgG | Abbkine | A23240 | |
| DAPI | BBI Life Science | E607303-0002 | |
| 显微观察 | BX63显微镜 | Olympus | -- |
| 细胞培养 | 高糖DMEM | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| 溶葡萄球菌素 | -- | -- | |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| L929成纤维细胞条件培养基 | -- | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 315-02 | |
| RNA提取与qPCR | RNAiso PLUS | Takara | 9109 |
| Evo M-MLV逆转录预混液 | Accurate Biology | AG11706 | |
| SYBR Green | Accurate Biology | AG11702 | |
| QuantStudio5 | Applied Biosystems | -- | |
| 杀菌实验 | 莲心碱 | Selleck | S9424 |
| mtROS检测 | MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| MitoTracker Green FM | Invitrogen | M7514 | |
| 线粒体自噬检测 | 线粒体自噬染料 | Invitrogen | MD01 |
| 溶酶体染料 | Invitrogen | MD01 | |
| 荧光成像 | 共聚焦激光显微镜LSM980 | Carl Zeiss | -- |
| 统计 | GraphPad Prism 7.0 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系（C57BL/6，10-12周龄）、麻醉剂量（三溴乙醇250 mg/kg）、注射细菌量（1×10^5 CFU/mL, 2 μL）、植入不锈钢针尺寸（2 mm长，0.3 mm直径）、庆大霉素剂量（20 mg/kg/day） 阅读提示：Materials and methods: Implant-associated osteomyelitis mouse model and treatments |
| 抗体阻断治疗 | PD-1抗体（BE0146）和PD-L1抗体（BE0101）的来源、剂量（200 μg/只，每3天一次）、给药途径（腹腔注射）、开始时间（感染后第5天）、庆大霉素处理 阅读提示：Materials and methods: Implant-associated osteomyelitis mouse model and treatments |
| 体外细胞感染 | MOI（0.1, 1, 10）、感染时间（1小时）、杀死胞外菌的溶葡萄球菌素（20 μg/mL）和庆大霉素（50 μg/mL）浓度、培养时间 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and treatments |
| 吞噬/杀菌实验 | BMDM数量（2×10^5 cells/well）、MOI=10、中和抗体浓度（10 μg/mL）、线粒体自噬抑制剂liensinine浓度（10 μM）、处理时间（12小时）、CFU计数方法 阅读提示：Materials and methods: Phagocytosis/intracellular killing assay |
| mtROS和线粒体自噬检测 | MitoSOX Red浓度（5 μM）、MitoTracker Green FM浓度（200 nM）、Mitophagy Dye浓度（100 nM）、Lyso Dye浓度（1 μM）、染色时间、感染时间点（0,4,12,24小时） 阅读提示：Materials and methods: Detection of mtROS and mitophagy |
| micro-CT分析 | 扫描参数（voxel size 24 μm, 电压55 kV, 电流145 mA, 积分时间400 ms）、ROI定义（333 slices centered at hole）、骨小梁参数（BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Pf） 阅读提示：Materials and methods: Micro-CT analysis |