构建oHSV可感染的胰腺癌细胞系
建立能够被oHSV感染并支持其复制的鼠源PDAC细胞系，以便在免疫功能正常的小鼠中研究oHSV的溶瘤和免疫效应。
通过慢病毒转导在Pan02细胞中稳定表达人HVEM受体，建立Pan02_HVEM细胞系；通过流式细胞术验证HVEM表达，并通过病毒滴定和蛋白印迹确认oHSV的感染和复制。
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溶瘤单纯疱疹病毒重塑小鼠胰腺导管腺癌的免疫微环境
Reshaping the Immune Microenvironment by Oncolytic Herpes Simplex Virus in Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma
实验完整度
高包含体外细胞感染与杀伤实验、同基因小鼠荷瘤模型、流式细胞术、单细胞RNA测序、单核细胞过继转移及联合治疗生存分析，并明确进行功能与机制验证。
主要模型
Pan02_HVEM小鼠胰腺导管腺癌皮下移植瘤模型 C57BL/6同基因小鼠模型 双侧肿瘤模型
重点核对
oHSV治疗剂量：1×10^7 PFU/只，瘤内注射，共3次 治疗时间点：肿瘤接种后第8、11、14天 细胞接种量：5×10^5个Pan02_HVEM细胞皮下注射 主要检测终点：肿瘤体积、重量、生存期及免疫细胞组成 统计方法：t检验或log-rank检验
摘要
胰腺导管腺癌（PDAC）是胰腺恶性肿瘤的主要类型，预后极差。尽管免疫检查点抑制剂（ICIs）在一些实体瘤中取得了有前景的结果，但由于其免疫抑制性肿瘤微环境（TME），免疫疗法对PDAC的效果较差。在本研究中，我们建立了一个免疫感受态的同基因PDAC模型，并研究了溶瘤单纯疱疹病毒-1（oHSV）对TME免疫细胞组成的影响。oHSV治疗显著减少了肿瘤负荷并延长了荷瘤小鼠的生存期。此外，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和多重荧光激活细胞分选（FACS）分析，我们证明oHSV给药下调了肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），尤其是抗炎巨噬细胞，并增加了肿瘤浸润淋巴细胞的比例，包括活化的细胞毒性CD8+ T细胞和辅助性T细胞（Th）1细胞。此外，oHSV与免疫检查点调节剂的联合治疗延长了荷瘤小鼠的寿命。总体而言，我们的数据表明，oHSV通过增强免疫活性重塑PDAC的TME，并提高了PDAC对免疫疗法的应答性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 溶瘤单纯疱疹病毒（oHSV）能否重塑胰腺导管腺癌（PDAC）的免疫抑制性肿瘤微环境，并增强PDAC对免疫治疗的反应性？
- 核心机制
- oHSV通过减少肿瘤相关巨噬细胞（尤其是M2型抗炎巨噬细胞）和调节性T细胞（Treg）的比例，增加CD8+ T细胞和CD4+ Th1细胞的浸润与活化，并将免疫抑制性TME转变为免疫活性状态，从而增强抗肿瘤免疫应答。
- 主要证据
- 在同基因PDAC小鼠模型中，oHSV治疗显著抑制肿瘤生长并延长生存期；scRNA-seq和流式细胞术显示oHSV治疗后M2型巨噬细胞和Treg减少，效应T细胞增加；联合抗CTLA-4和抗OX40抗体进一步延长生存期。
- 研究意义
- 本研究为选择与oHSV联合的免疫治疗药物提供了理论基础，提示oHSV与免疫调节剂联合可能成为PDAC的一种治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证oHSV的溶瘤活性
评估oHSV对Pan02_HVEM细胞的直接杀伤和细胞病变效应。
将Pan02_HVEM细胞与oHSV共培养，检测细胞凋亡、细胞增殖抑制和细胞病变效应。
在小鼠模型中验证oHSV的抗肿瘤效果
评估oHSV在体内对PDAC肿瘤生长和荷瘤小鼠生存期的影响。
在C57BL/6小鼠皮下接种Pan02_HVEM细胞，待肿瘤形成后瘤内注射oHSV，定期测量肿瘤体积，记录生存期，并检测病毒在体内的复制。
分析oHSV对肿瘤微环境免疫细胞组成的影响
揭示oHSV治疗后PDAC肿瘤组织中免疫细胞亚群的变化。
通过多色流式细胞术和单细胞RNA测序分析肿瘤浸润免疫细胞的类型、比例和基因表达谱。
单核细胞过继转移和T细胞增殖实验
验证oHSV处理后的单核细胞对肿瘤生长和CD8+ T细胞增殖的功能影响。
从oHSV处理或PBS处理的小鼠肿瘤中分离CD11b+单核细胞，过继转移至荷瘤小鼠，或与CD8+ T细胞共培养，观察对肿瘤生长和T细胞增殖的影响。
联合治疗评估
探索oHSV与免疫检查点抑制剂或激动剂联合治疗对PDAC小鼠生存期的影响。
在荷瘤小鼠中分别给予oHSV单独或联合抗PD-1、抗TIM-3、抗LAG-3抗体，或联合抗CTLA-4和抗OX40抗体，监测生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞培养与病毒制备
体外功能验证
体内抗肿瘤效果评估
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒纯化 | HiScreen Capto Core 700 | GE Healthcare | 17-5481-15 |
| ÄKTA蛋白质纯化系统 | -- | -- | |
| 超滤管 | Millipore | UFC910096 | |
| Vero细胞宿主残留蛋白ELISA试剂盒 | Cygnus | F500 | |
| 抗体检测 | 抗HVEM抗体 | R&D Systems | MAB356 |
| Western blot | 抗HSV-1抗体 | Dako | B0114 |
| 抗GAPDH抗体 | Sungene | KM9002 | |
| 细胞凋亡检测 | APC偶联的Annexin V | Sungene | AO2001 |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | UE | C6005 |
| 肿瘤组织解离 | I型胶原酶 | -- | -- |
| 脱氧核糖核酸酶 | -- | -- | |
| 分散酶II | -- | -- | |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 |
| 流式细胞术 | 抗CD45抗体 | BioLegend | 103108 |
| 抗CD3ε抗体 | BioLegend | 100328 | |
| 抗CD4抗体 | BioLegend | 100428 | |
| 抗CD8抗体 | BioLegend | 100752 | |
| 抗CD25抗体 | BioLegend | 102036 | |
| 抗PD-1抗体 | BioLegend | 135228 | |
| 抗CD11b抗体 | BioLegend | 101224 | |
| 抗F4/80抗体 | BioLegend | 123114 | |
| 抗CD206抗体 | BioLegend | 141732 | |
| 抗Ly6C抗体 | BioLegend | 128033 | |
| 抗Ly6G抗体 | BioLegend | 127639 | |
| 抗Foxp3抗体 | BioLegend | 320014 | |
| 抗iNOS抗体 | eBioscience | 12-5920-82 | |
| 抗IFN-γ抗体 | BioLegend | 505846 | |
| 抗GZMB抗体 | BioLegend | 372208 | |
| True Nuclear 转录因子缓冲液套装 | BioLegend | 424401 | |
| 免疫组化 | 抗CD4抗体 | Cell Signaling Technology | 25229 |
| 抗CD8抗体 | Cell Signaling Technology | 98941 | |
| 抗Foxp3抗体 | Cell Signaling Technology | 12653 | |
| 抗F4/80抗体 | Cell Signaling Technology | 70076 | |
| 抗iNOS抗体 | Abcam | ab15323 | |
| 抗甘露糖受体抗体 | Abcam | ab64693 | |
| 单核细胞分离 | CD11b磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-126-725 |
| T细胞分离 | CD8a+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-075 |
| T细胞增殖 | CFSE | BD | 565082 |
| 抗CD3抗体 | BioLegend | 102111 | |
| 抗CD28抗体 | BioLegend | 100208 | |
| scRNA-seq | 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 |
| CD45（TIL）磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-110-618 | |
| 10x Genomics Chromium平台 | 10x Genomics | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 热循环仪C1000 | Bio-Rad | -- | |
| Agilent Bioanalyzer 2100 | Agilent | -- | |
| 动物实验 | 抗PD-1抗体 | Bio X Cell | BE0146 |
| 抗TIM-3抗体 | Bio X Cell | BE0115 | |
| 抗LAG-3抗体 | Bio X Cell | BE0174 | |
| 抗CTLA-4抗体 | Bio X Cell | BE0164 | |
| 抗OX40激动剂抗体 | Bio X Cell | BE0031 | |
| 同型对照抗体（抗IgG2a） | Bio X Cell | BE0089 | |
| 同型对照抗体（抗IgG1） | Bio X Cell | BE0088 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系构建 | 人HVEM编码序列、慢病毒载体（pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro）、嘌呤霉素筛选浓度（1.25 μg/mL）及筛选时间（7天） 阅读提示：Materials and Methods: Establishment of Pan02_HVEM Cells |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系（C57BL/6）、性别（雄性）、年龄（6-8周龄）、细胞接种量（5×10^5个）、接种途径（皮下）、肿瘤体积达50 mm³时的处理时间点（第8、11、14天） 阅读提示：Materials and Methods: Mice and PDAC Tumor Model |
| oHSV治疗 | oHSV剂量（1×10^7 PFU/只）、注射体积（100 μL）、注射途径（瘤内）、治疗频率（每3天一次，共3次）及对照组（PBS） 阅读提示：Materials and Methods: Mice and PDAC Tumor Model |
| 免疫细胞分析 | 肿瘤组织单细胞悬液制备方法（胶原酶I、DNase、Dispase II消化）、染色抗体克隆号及浓度、流式细胞术的圈门策略（如CD45+、CD3+、CD4+、CD8+、Foxp3+等） 阅读提示：Materials and Methods: Dissociation of Single Cells from Tumor Tissues, Flow Cytometry Analysis; Figure S4 (gating strategy) |
| 单细胞RNA测序 | CD45+细胞分选流程（死细胞去除、CD45磁珠）、10x Genomics平台参数（约1000细胞/μL，总共约20000细胞）、数据分析软件版本（Cell Ranger 3.1.0，Seurat，参考基因组mm10-3.0.0） 阅读提示：Materials and Methods: Preparation for scRNA-Seq Library, Data Processing and Analysis |
| 联合治疗 | 抗体种类（抗PD-1、抗TIM-3、抗LAG-3、抗CTLA-4、抗OX40）、剂量（100 μg/只）、给药途径（腹腔注射）、治疗时间点（第8、11、14天）及对照组设置 阅读提示：Materials and Methods: Therapeutic Administration and Survival; Figure 8 |