验证引物编辑器在哺乳动物基因组中的可行性
测试PE3系统是否能在HEK293T细胞中实现靶向诱变
使用tdTomato报告系统，设计pegRNA在AAVS1位点插入T核苷酸产生终止密码子，通过流式细胞术检测tdTomato阴性细胞比例。
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使用增强型引物编辑器在小鼠细胞和胚胎中进行靶向诱变
Targeted mutagenesis in mouse cells and embryos using an enhanced prime editor
实验完整度
高包含细胞系、胚胎和动物模型等多个证据层级，并通过功能验证（表型分析）和机制验证（DNase I消化实验）证实编辑效率提升与染色质开放相关。
主要模型
HEK293T细胞（tdTomato报告系统） NIH/3T3细胞 C2C12细胞 小鼠胚胎 Igf2突变小鼠
重点核对
pegRNA的PBS长度和RT模板长度 近端dsgRNA的设计及位置 CMP-PE-V1和CMP-PE-V2的添加 细胞系选择（NIH/3T3、C2C12） 电转染或显微注射的投递方式
摘要
引物编辑器是一种新型基因组编辑工具，由CRISPR-Cas9切口酶和工程化逆转录酶组成，可诱导靶向诱变。然而，优化和提高引物编辑效率仍需大量努力。在此，我们介绍了两种使用近端死sgRNA和染色质调节肽来提高编辑效率的策略。我们使用增强型引物编辑技术生成了编辑频率高达47%的Igf2突变小鼠，并观察到种系传递、无脱靶效应和侏儒表型。这种改进的引物编辑方法可有效应用于细胞研究和小鼠模型生成。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 引物编辑器在小鼠细胞和胚胎中的编辑效率较低，如何提高其效率并用于生成小鼠模型？
- 核心机制
- 近端dsgRNA和染色质调节肽（CMP）通过打开靶位点的染色质结构，提高染色质可及性，进而增强引物编辑效率。
- 主要证据
- 在NIH/3T3和C2C12细胞中，CMP-PE3-V1+dsgRNA相比PE3在Igf2、Adamts20和Hoxd13位点编辑效率分别提升高达4.20倍、5.11倍和3.56倍；在小鼠胚胎中，CMP-PE3-V1+dsgRNA在Igf2位点实现了21/22（95%）的编辑效率；DNase I消化实验证明CMP-PE-V1和dsgRNA能打开染色质。
- 研究意义
- 改进的引物编辑器可高效应用于细胞研究和小鼠模型生成，尤其在插入或转换一个或多个核苷酸的靶向诱变中具有应用前景。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
设计并优化pegRNA
针对Igf2和Adamts20位点优化pegRNA的PBS和RT模板长度，以提高编辑效率
设计不同PBS长度（8-14nt）和RT模板长度（10-18nt）的pegRNA，转染NIH/3T3细胞后通过靶向深度测序检测编辑效率。
使用近端dsgRNA提高编辑效率
检验近端dsgRNA是否能通过改变染色质结构提高引物编辑效率
设计近端dsgRNA，与PE3系统共转染，比较不同位点（Igf2、Adamts20、Casp1等）的编辑效率。
使用染色质调节肽提高编辑效率
检验CMP-PE-V1和CMP-PE-V2是否能提高编辑效率
构建CMP-PE-V1和CMP-PE-V2表达载体，与PE3比较编辑效率，并测试与dsgRNA的协同效应。
验证染色质开放机制
确认CMP-PE-V1和dsgRNA是否通过打开染色质结构提高编辑效率
进行DNase I消化实验和实时qPCR检测靶位点的染色质状态，比较PE3、PE3+dsgRNA、CMP-PE3-V1和CMP-PE3-V1+dsgRNA处理后的变化。
在小鼠胚胎中评估编辑效率
测试改进的引物编辑系统在小鼠胚胎中的效率
通过显微注射将PE3、PE3+dsgRNA、CMP-PE3-V1、CMP-PE3-V1+dsgRNA注入小鼠受精卵，培养4天后检测编辑效率。
生成Igf2突变小鼠并评估表型和种系传递
验证改进的引物编辑器能否生成具有预期表型和种系传递的小鼠模型
使用CMP-PE3-V1+dsgRNA系统显微注射小鼠胚胎，移植至代孕母鼠，对出生的后代进行基因型、表型（体重）和种系传递分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 载体构建 | NEBuilder® HiFi DNA组装预混液 | NEB | E2621L |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Welgene | LM001-05 |
| 胎牛血清 | Welgene | S | |
| 小牛血清 | Gibco | 26170-043 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985070 | |
| 电穿孔 | Neon™转染系统 | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 |
| 流式分析 | BD FACSCanto™流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69506 |
| PCR扩增 | Phusion™高保真DNA聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | F-530XL |
| Sungen试剂 | Sun genetics | SG-PT02 | |
| 体外转录 | mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra试剂盒 | Invitrogen | AM1345 |
| RNA纯化 | MEGAclear™转录清理试剂盒 | Invitrogen | AM1908 |
| 体外转录 | T7 RNA聚合酶 | NEB | M0251 |
| RNA纯化 | ExpinTM CleanUp SV试剂盒 | GeneAll | 113-150 |
| RNA定量 | NanoDrop One紫外可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 动物处理 | HyperOva超排试剂 | CARD | KYD-010-EX-x5 |
| 人绒毛膜促性腺激素 | Sigma | CG10-1vl | |
| 胚胎培养 | M2培养基 | Sigma | M7167 |
| KSOM培养基 | Millipore | MR-121-D | |
| 深度测序 | iSeq™ 100测序系统 | Illumina | -- |
| 全基因组测序 | Covaris S2超声波破碎仪 | Covaris | -- |
| Truseq Nano DNA样品制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| Illumina Novaseq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| DNase I消化实验 | IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 |
| DNase I | -- | -- | |
| qPCR | KAPA SYBR FAST qPCR预混液试剂盒 | Kapa Biosystems | KR0389 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 质粒构建 | 载体骨架（pCMV-PE2、pU6-pegRNA-GG-acceptor、pRG2-GG）、组装方法（NEBuilder HiFi DNA Assembly）、插入片段序列 阅读提示：Methods: Plasmid DNA construction, Additional file 1: Tables S2 and S4 |
| 细胞培养与转染 | 细胞系（HEK293T、NIH/3T3、C2C12）、培养基（DMEM）、血清（FBS/BCS）、转染试剂（Lipofectamine 2000或Neon电转）、质粒用量（pegRNA、PE2、nsgRNA、dsgRNA） 阅读提示：Methods: Lipofection and electroporation |
| 流式分析 | 检测时间（10天）、gating策略（tdTomato阴性） 阅读提示：Methods: Flow cytometric analysis, Additional file 1: Figure S1 |
| 靶向深度测序 | PCR引物、测序平台（iSeq 100）、数据分析工具（CRISPR REGN, EUN） 阅读提示：Methods: Genotyping and targeted deep sequencing, Additional file 1: Table S4 |
| 体外转录与显微注射 | RNA浓度（PE2/CMP-PE mRNA 100ng、pegRNA 65ng、nsgRNA 32.5ng、dsgRNA 22ng）、胚胎品系（C57BL/6N）、注射时机、培养条件（KSOM培养基） 阅读提示：Methods: In vitro transcription, Microinjection |
| DNase I消化实验 | 细胞数目、DNase I浓度（2-16U）、消化时间（20-30分钟）、qPCR引物 阅读提示：Methods: DNase I digestion assay and qPCR, Additional file 1: Table S5 |
| 全基因组测序 | 测序平台（Novaseq 6000）、覆盖深度（30x）、比对软件（BWA-MEM）、变异检测（GATK4）、脱靶分析（Cas-OFFinder） 阅读提示：Methods: Whole-genome sequencing and variant calling |