建立靶基因沉默模型
验证脂质偶联siRNA能否有效沉默肿瘤微环境中免疫细胞的靶基因mRNA。
使用人肿瘤异种移植或同系肿瘤模型，经皮下注射RNAi-ALDH2（对照靶点）或RNAi-STAT3/PDL1，收集肿瘤及引流淋巴结，通过qPCR或RNAscope检测靶mRNA水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肿瘤相关免疫细胞中STAT3/PD-L1的RNAi沉默在免疫治疗抵抗肿瘤中诱导强效抗肿瘤效应
RNAi mediated silencing of STAT3/PD-L1 in tumor-associated immune cells induces robust anti-tumor effects in immunotherapy resistant tumors
实验完整度
高包含体外细胞分化实验、多种小鼠肿瘤模型（同系移植、人源异种移植）、功能验证（敲低靶基因）、机制验证（CD36介导摄取）及体内疗效和安全性评估。
主要模型
小鼠同系肿瘤模型（Pan02、4T1、MC-38、Hepa1-6、CT26） 人肿瘤异种移植模型（LS411N、PANC1） CD36基因敲除小鼠 人PBMC来源的树突状细胞分化模型
重点核对
RNAi-lipid偶联物类型（C16、C18、C22、C24）及给药剂量（10-50 mg/kg） 给药途径（皮下）及给药方案（单次或多次） 靶基因沉默效率（mRNA水平，通过qPCR或RNAscope） 肿瘤模型及免疫表型（CPI抵抗型如Pan02、4T1 vs. 敏感型如Hepa1-6、MC-38） CD36受体在免疫细胞上的表达水平及其对递送的必要性
摘要
恶性肿瘤常伴随免疫抑制性肿瘤微环境（TME），导致大多数肿瘤对标准免疫检查点抑制剂（CPIs）产生抵抗。信号转导与转录激活因子3（STAT3）是一种广泛表达的转录因子，在TME中的多个白细胞群体中具有明确的免疫抑制功能。由于STAT3蛋白难以用常规药物方式靶向，我们研究了系统性递送RNA干扰（RNAi）药物直接沉默肿瘤相关免疫细胞中其mRNA的可行性。在临床前啮齿动物肿瘤模型中，化学稳定化的脂酰化小干扰RNA（siRNAs）选择性地沉默了多种相关细胞类型中的Stat3 mRNA，降低了STAT3蛋白水平，并增加了细胞毒性T细胞浸润。在CPI抵抗的胰腺癌小鼠模型中，RNAi介导的Stat3沉默导致肿瘤生长抑制，并与CPI联合使用时进一步增强。为了进一步展示RNAi在癌症免疫治疗中的效用，该技术被用于沉默Cd274，即编码免疫检查点蛋白程序性死亡配体1（PD-L1）的基因。有趣的是，Cd274的沉默在对PD-L1抗体治疗抵抗的肿瘤模型中是有效的。这些数据代表了系统性递送RNAi药物到TME的首次演示，并表明将该技术应用于免疫肿瘤学领域。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 系统性递送的RNAi药物能否靶向肿瘤相关免疫细胞中的STAT3或PD-L1，从而克服免疫治疗抵抗？
- 核心机制
- 脂质偶联siRNA通过CD36受体被肿瘤相关免疫细胞摄取，沉默STAT3或Cd274基因，降低免疫抑制功能，增强T细胞浸润和抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- 在多种小鼠肿瘤模型（Pan02、4T1、MC-38、Hepa1-6）中，RNAi-STAT3或RNAi-PDL1单药或联合抗PD-L1抗体显著抑制肿瘤生长，增加CD8+ T细胞浸润和细胞毒性标志物，而在CD36 KO小鼠或免疫功能缺陷小鼠中效果丧失。
- 研究意义
- 该技术提供了一种新的癌症免疫治疗策略，可能对免疫治疗抵抗的患者有效，并支持将RNAi治疗应用于肿瘤微环境中的免疫细胞靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定靶细胞群
确定siRNA递送和基因沉默发生在哪些肿瘤相关免疫细胞亚群中。
通过MACS从肿瘤中分离CD11b+细胞、MDSC亚群（G-MDSC、M-MDSC）或引流淋巴结中的CD11b+和CD11c+细胞，然后检测靶基因mRNA水平。
评估单药和联合抗肿瘤疗效
测试RNAi-STAT3或RNAi-PDL1单药及其与免疫检查点抑制剂联合的肿瘤生长抑制效果。
在免疫健全小鼠中建立同系肿瘤（Pan02、4T1、MC-38、Hepa1-6），按方案给药，测量肿瘤体积，观察肿瘤生长抑制和存活。
评估免疫细胞浸润和表型变化
确认治疗后肿瘤微环境中免疫细胞浸润和激活标志物的变化。
通过免疫组化检测pSTAT3、CD8、颗粒酶B、穿孔素等蛋白变化；通过Nanostring基因表达分析检测免疫相关基因变化。
验证CD36介导的递送机制
证明CD36受体是脂质偶联siRNA被肿瘤相关免疫细胞摄取的必要条件。
使用CD36敲除小鼠和体外PBMC分化DC模型，检测CD36表达与siRNA摄取和基因沉默的关联。
初步安全性评估
评估人源活性STAT3和PDL1偶联物的非临床安全性。
进行小鼠和猴的5周毒性研究，检测最大耐受剂量、心血管功能、遗传毒性等。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞处理 | 白细胞介素-4 | Peprotech | -- |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- | |
| 白细胞介素-10 | Peprotech | -- | |
| RNA提取 | RNeasy RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| RT-qPCR | 高通量cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4368813 |
| TaqMan快速高级预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| RNAscope | RNAscope 2.5 HD检测试剂盒（红色） | ACD | 322350 |
| 免疫组织化学 | 抗pSTAT3抗体（9145） | Cell Signaling | 9145 |
| 抗穿孔素抗体（31647） | Cell Signaling | 31647 | |
| 抗颗粒酶B抗体（44153） | Cell Signaling | 44153 | |
| 抗CD8抗体（ab209775） | Abcam | ab209775 | |
| Signal Stain DAB底物试剂盒 | Cell Signaling | 8059 | |
| Omni Map抗兔HRP试剂盒 | Ventana | 760-4311 | |
| 细胞分选 | GentleMACS小鼠组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-730 |
| CD11b磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| MDSC分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-094-538 | |
| 药物处理 | 抗小鼠PD-L1抗体 | Bio X Cell | -- |
| 抗小鼠CTLA-4抗体 | Bio X Cell | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系和培养 | 细胞系来源和培养条件：如Pan02、4T1、MC-38、Hepa1-6等细胞系的生长培养基、添加物（如FBS），以及培养条件（温度、CO2浓度） 阅读提示：Materials and methods - Cell lines |
| 动物模型建立 | 小鼠品系（C57BL/6、Balb/c、nude、CD36 KO）、细胞接种数量、接种部位、肿瘤生长至目标大小（300-400 mm3）的时间 阅读提示：Materials and methods - Murine tumor models |
| RNAi给药 | siRNA偶联物类型（C16、C18等）、剂量（25或50 mg/kg）、给药途径（皮下）、给药体积（10 mL/kg）、给药频率（如每周一次） 阅读提示：Materials and methods - Murine tumor models; Results - Structure-activity relationship |
| 联合治疗 | 抗PD-L1或抗CTLA-4抗体的剂量（10 mg/kg）、给药途径（腹腔）、给药频率（如每周一次） 阅读提示：Results - STAT3 inhibition in combination...; Materials and methods - Murine tumor models |
| 检测方法 | qPCR引物探针序列（如Mm01198461_m1等）、RNAscope探针（ALDH2等）、IHC抗体及稀释比例、图像分析软件（Halo）参数设置 阅读提示：Materials and methods - Quantitative RT-PCR measurements, RNAscope, Immunohistochemistry |
| CD36机制验证 | CD36 KO小鼠来源、肿瘤细胞系（Pan02）接种数量、RNAi-PDL1剂量和给药方案、TDLN和肿瘤样本收集时间点 阅读提示：Results - The fatty acid transporter CD36...; Materials and methods - Murine tumor models |