EVs中包含OBP-301的验证
验证OBP-301或其组分是否存在于经处理细胞分泌的EVs中。
使用透射电镜观察EVs形态，免疫荧光染色检测腺病毒与EVs共定位，动态光散射测量粒径，使用ExoCap纯化EVs，并通过qRT-PCR和Western blot检测腺病毒E1A基因和蛋白的存在。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
局部溶瘤腺病毒疗法通过肿瘤来源的细胞外囊泡产生远隔效应
Local oncolytic adenovirotherapy produces an abscopal effect via tumor-derived extracellular vesicles
实验完整度
高包含体外细胞实验、双侧皮下及原位转移瘤动物模型，并进行功能验证和机制验证（EVs介导）
主要模型
HCT116人结肠癌细胞系 SW48人结肠癌细胞系 CT26小鼠结肠癌细胞系 BALB/c裸鼠双侧皮下肿瘤模型 BALB/c小鼠CT26双侧皮下肿瘤模型 NOD/SCID小鼠CT26双侧皮下肿瘤模型 BALB/c裸鼠原位直肠肿瘤肝转移模型
重点核对
OBP-301是否为EVs包裹（EC纯化和qRT-PCR检测E1A） Exo301的细胞毒活性是否由EVs介导（抗CD63抗体阻断实验） GW4869是否抑制EVs分泌并阻断远隔效应 远隔效应是否不依赖免疫激活（免疫缺陷小鼠中的效果） 肿瘤来源EVs的肿瘤趋向性（原位模型中的生物分布）
摘要
细胞外囊泡（EVs）在多种细胞间通讯过程中发挥重要作用。远隔效应是癌症治疗中的一个有趣现象，通常认为免疫激活是其主要因素。我们之前开发了一种端粒酶特异性溶瘤腺病毒Telomelysin（OBP-301），并在免疫缺陷小鼠中局部治疗后偶尔观察到对远端肿瘤的治疗效果。在本研究中，我们假设EVs可能参与OBP-301的远隔效应。从经OBP-301处理的人结肠癌细胞HCT116的上清中分离的EVs被证实含有OBP-301，并表现出与OBP-301相似的细胞毒性活性（凋亡和自噬）。在双侧皮下HCT116和CT26肿瘤模型中，瘤内注射OBP-301对未直接接受OBP-301治疗的肿瘤产生有效的抗肿瘤作用，其中涉及含有OBP-301的肿瘤来源EVs的直接介导。这表明免疫激活不是这种远隔效应的主要因素。此外，肿瘤来源的EVs在原位HCT116直肠肿瘤中表现出高度的肿瘤趋向性，在局部直肠肿瘤治疗后，在转移性肝肿瘤中观察到腺病毒E1A和腺病毒5型蛋白。总之，局部OBP-301治疗有可能通过肿瘤来源的EVs产生远隔效应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 局部溶瘤腺病毒治疗是否通过肿瘤来源的细胞外囊泡产生远隔效应，以及其机制是否不依赖于免疫激活。
- 核心机制
- 肿瘤来源的细胞外囊泡包裹OBP-301或病毒组分，将其递送至远端肿瘤，直接介导抗肿瘤效应，而非通过系统性免疫激活。
- 主要证据
- 体外实验显示Exo301含有OBP-301且具有细胞毒性；体内双侧肿瘤模型中，OBP-301对未治疗肿瘤的抑制被GW4869阻断，且在免疫缺陷和免疫正常小鼠中均有效；原位模型中检测到E1A和Ad5在转移性肝肿瘤中积累。
- 研究意义
- 该研究揭示了一种不同于免疫激活的远隔效应机制，提示肿瘤来源EVs作为癌症治疗药物递送载体的潜力，并可能适用于其他溶瘤病毒。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Exo301细胞毒活性检测
评估Exo301是否具有与OBP-301相似的细胞毒性机制。
使用XTT法测定细胞活力，Western blot检测凋亡（PARP切割）和自噬（p62降低）标志物，qRT-PCR检测病毒复制情况，并通过抗CD63抗体阻断实验验证EVs介导的细胞毒性。
体外共培养模型验证EVs递送肿瘤物质
验证肿瘤细胞分泌的物质是否通过EVs递送至远端细胞。
建立非接触共培养系统，HCT116-RFP细胞在底室，HCT116细胞在上室，用OBP-301或PBS处理底室细胞，并加入GW4869抑制EVs分泌，通过Western blot和流式细胞术检测RFP的传递。
体内双侧肿瘤模型验证远隔效应
验证局部注射OBP-301是否通过肿瘤来源EVs对远端肿瘤产生抗肿瘤效应。
建立双侧皮下肿瘤模型，对一侧肿瘤进行瘤内注射OBP-301或PBS，并腹腔注射GW4869，监测对侧未治疗肿瘤的体积变化，并通过IHC检测远端肿瘤中RFP、E1A和Ad5的表达。
肿瘤来源EVs肿瘤趋向性评估
评估肿瘤来源EVs是否优先归巢到肿瘤组织。
体外三培养模型观察RFP递送至肿瘤细胞而非正常细胞，体内原位直肠肿瘤肝转移模型检测OBP-301治疗后转移肝肿瘤中RFP、E1A和Ad5的表达，并与主要器官比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| EVs染色 | PKH26红色荧光细胞连接试剂盒 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT |
| 细胞染色 | CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 |
| CellTracker Blue CMAC | Invitrogen | C2110 | |
| EVs纯化 | ExoCap链霉亲和素CD9/CD63/CD81试剂盒 | MBL International | MEX-SA123 |
| EVs分泌抑制 | GW4869 | Sigma-Aldrich | -- |
| 病毒滴度测定 | Adeno-X快速滴度试剂盒 | Clontech Laboratories | 632250 |
| 蛋白质浓度测定 | BCA法 | Thermo Scientific | -- |
| EVs粒径测量 | Zetasizer Nano ZSP | Malvern Instruments | -- |
| EVs形态观察 | 透射电子显微镜(H-7560) | Hitachi | -- |
| 细胞活力检测 | 细胞增殖检测试剂盒II (XTT) | Roche | -- |
| Western blot 封闭 | Blocking-One | Nacalai Tesque | -- |
| 免疫荧光染色 | FITC标记的抗腺病毒抗体（Hexon） | Chemicon | AB1056F |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| 共聚焦显微镜 | LMS 780激光扫描共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| 流式细胞术 | BD FACSLyric | BD Biosciences | -- |
| RNA提取 | miRNeasy小提试剂盒 | QIAGEN | -- |
| EVs RNA提取 | 总外泌体RNA和蛋白提取试剂盒 | Invitrogen | -- |
| qRT-PCR | StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| Western blot 抗体 | 抗E1A抗体 | BD Pharmingen | 554155 |
| 抗PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| 抗p62抗体 | Cell Signaling Technology | 5114 | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A-5441 | |
| 抗CD9抗体 | Invitrogen | 10626D | |
| 抗RFP抗体 | Invitrogen | R10367 | |
| 免疫荧光二抗 | 抗小鼠IgG Alexa Fluor 647二抗 | Invitrogen | A21237 |
| IHC 抗体 | 抗E1A抗体 | Bioss | bs-7697R |
| 抗Ad5抗体 | Abcam | ab6982 | |
| IHC 显色 | DAB显色液 | Dako | -- |
| 体内成像 | IVIS成像系统 | Xenogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EVs分离与纯化 | EVs分离方法（超速离心、ExoCap）、细胞处理条件（MOI、时间）、纯化试剂盒 阅读提示：Materials and methods: Isolation and characterization of EVs |
| 细胞毒性实验 | 细胞系、初始接种密度、处理浓度、处理时间、检测方法（XTT） 阅读提示：Materials and methods: Cell viability assay |
| 共培养模型 | 细胞系、细胞数量、培养板孔径、处理条件（MOI、时间）、GW4869浓度 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry |
| 体内远隔效应实验 | 动物品系、细胞接种数量、OBP-301剂量、GW4869剂量、处理时间间隔、监测周期 阅读提示：Materials and methods: In vivo experiments |
| 原位肿瘤模型 | 细胞接种数量、植入部位、OBP-301剂量、GW4869剂量、处理时间间隔、取材时间 阅读提示：Materials and methods: In vivo experiments |