抗体筛选与鉴定
获得非中和性、高亲和力的TNF-α抗体，能够搭载TNF-α并与其受体形成复合物。
利用合成噬菌体Fab文库对重组鼠TNF-α进行三轮筛选，随后将噬菌体库亚克隆至酵母表面展示载体，通过两轮FACS筛选高亲和力克隆。鉴定出Pigbak#1和Pigbak#2抗体，并通过细胞实验和BLI验证其非中和性和搭载能力。
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一种TNF-α介导的细菌癌症治疗特洛伊木马策略的开发
Development of a TNF-α-mediated Trojan Horse for bacteria-based cancer therapy
实验完整度
高包含抗体筛选（噬菌体/酵母展示）、体外细胞毒性实验、细菌工程改造、小鼠肿瘤模型及肿瘤浸润免疫细胞分析等多个独立证据层级，并进行了功能与机制验证。
主要模型
B16F10小鼠黑色素瘤细胞系 4T1小鼠乳腺癌细胞系 L929小鼠成纤维细胞系 C57BL/6小鼠皮下B16F10黑色素瘤模型
重点核对
抗体筛选方法：噬菌体展示与酵母表面展示的具体筛选轮次和抗原浓度 抗体非中和性验证：中和实验和L929细胞活力实验的具体条件 内化验证：温度依赖性摄取实验和免疫荧光共定位实验的条件 细胞毒性实验：ADC/免疫毒素的浓度范围和TNF-α浓度范围 动物实验：B16F10细胞接种量、细菌注射剂量和给药途径
摘要
肿瘤坏死因子α（TNF-α）在包括肿瘤在内的慢性炎症环境中上调，并已被认为是多种癌症中的促肿瘤因子。然而，应用传统的中和TNF-α活性的TNF-α抗体在临床研究中仅表现出适度的抗肿瘤疗效。在此，我们开发了一种不同于中和机制的靶向TNF-α的创新方法。我们利用噬菌体展示和酵母展示筛选了非中和抗体，这些抗体可以搭载TNF-α并通过受体连接共同内化进入细胞。当与毒素偶联时，该抗体以TNF-α依赖的方式对癌细胞表现出细胞毒性。我们进一步将该免疫毒素应用于一种专门设计用于高分泌水平的大肠杆菌载体。在同基因小鼠黑色素瘤模型中，细菌刺激TNF-α表达，与分泌的免疫毒素协同作用，大大抑制了肿瘤生长。该治疗还显著重塑了肿瘤微环境，有利于多种抗肿瘤免疫细胞，包括N1中性粒细胞、M1巨噬细胞以及活化的CD4+和CD8+淋巴细胞。我们预计我们新的搭载策略可推广到靶向其他可溶性配体和/或与不同药物偶联，以管理多种疾病。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否设计非中和性TNF-α抗体，使其搭载TNF-α并内化进入癌细胞，从而递送毒性载荷，并利用细菌载体增强抗肿瘤效果？
- 核心机制
- 非中和性TNF-α抗体结合TNF-α后，不影响TNF-α与其受体的结合，并可通过TNF-α介导的内吞作用与TNF-α共同内化进入癌细胞，从而递送细胞毒性载荷；细菌载体通过刺激TNF-α表达，促进免疫毒素的内化，并调节肿瘤微环境中的免疫细胞极化。
- 主要证据
- 噬菌体展示和酵母展示筛选出高亲和力非中和抗体Pigbak#2；细胞实验证实其TNF-α依赖的内化和细胞毒性；小鼠模型中，分泌Pigbak#2-PE38的大肠杆菌抑制肿瘤生长并延长生存期，同时增加N1中性粒细胞、M1巨噬细胞和活化T细胞的比例。
- 研究意义
- 该方法提供了一种靶向TNF-α的新策略，可推广至其他可溶性配体，并可与不同药物偶联，用于多种疾病的治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外内化验证
证实Pigbak#2能够以TNF-α依赖的方式与TNF-α共同内化进入癌细胞。
使用B16F10和4T1细胞进行温度依赖性摄取实验和免疫荧光共定位实验，观察TNF-α和Pigbak#2的内化情况。
ADC/免疫毒素质控与体外毒性实验
验证Pigbak#2偶联毒性载荷后是否具有TNF-α依赖的细胞毒性。
将Pigbak#2与DM1偶联（DAR=4.1），或构建Pigbak#2-PE25/PE38免疫毒素，处理B16F10细胞并测定细胞活力。
细菌工程与分泌验证
构建能够分泌免疫毒素的工程大肠杆菌，并验证其分泌能力和在肿瘤中的定植能力。
利用CRISPR-Cas9敲除BL21(DE3)的lpp基因，构建Δlpp泄漏菌株。转化Pigbak#2-PE38质粒，通过western blot检测分泌；通过瘤内注射后测定肿瘤内CFU和质粒稳定性。
体内抗肿瘤疗效评估
验证分泌免疫毒素的工程菌在黑色素瘤小鼠模型中的抗肿瘤效果。
在C57BL/6小鼠皮下接种B16F10细胞，待肿瘤体积达100-200 mm³时，单次瘤内注射PBS、对照菌或Pigbak#2-PE38菌，监测肿瘤生长和生存期。
肿瘤微环境免疫分析
评估治疗对肿瘤浸润免疫细胞类型和极化的影响。
治疗4天后取肿瘤组织，消化成单细胞悬液，通过流式细胞术分析CD45+细胞中中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞亚群及其标记物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体筛选 | 链霉亲和素磁珠 | -- | -- |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 蛋白质表达 | 聚乙烯亚胺 | -- | -- |
| 蛋白质纯化 | 镍氮三乙酸树脂 | -- | -- |
| HiTrap蛋白A高效液相色谱柱 | -- | -- | |
| 抗体偶联 | SMCC-DM1 | MedChemExpress | HY-101070 |
| 细胞实验 | 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | BD Pharmingen | -- |
| 流式细胞术 | 链霉亲和素-AF647 | -- | -- |
| 抗His-APC抗体 | Biolegend | 362605 | |
| 蛋白质定量 | 小鼠炎症细胞计数微球阵列试剂盒 | BD Biosciences | 552364 |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 |
| 细菌工程 | pCas质粒 | Addgene | #62225 |
| pTargetF质粒 | Addgene | #62226 | |
| 动物实验 | IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5138 |
| 牛胰腺脱氧核糖核酸酶I | Cyrusbioscience | 101-9003-98-9 | |
| 流式细胞术 | 可固定活力染料eFluor-780 | eBioscience | 65-0865 |
| 微生物培养 | 溶菌肉汤琼脂 | -- | -- |
| 2× YT培养基 | Sigma | -- | |
| 蛋白质表达 | 异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷 | -- | -- |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 抗体筛选 | 生物素化小鼠TNF-α | Sino Biological | 50349-MNAE-B |
| 重组小鼠TNF-α | Sino Biological | 50349-MNAE | |
| 小鼠TNFR1胞外域 | Sino Biological | 50496-M08H | |
| 小鼠TNFR2胞外域 | Sino Biological | 50128-M08H | |
| ELISA检测 | M13噬菌体辣根过氧化物酶偶联物 | Sino Biological | 11973-MM05T-H |
| 细胞培养 | 细菌蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78243 |
| 沉淀促进剂 | Merck Millipore | 69049 | |
| 蛋白L-FITC | Acrobiosystem | RPL-PF141 | |
| 流式细胞术 | 抗HA-AF647抗体 | Biolegend | 682404 |
| 抗His-PE抗体 | Biolegend | 362603 | |
| MP6-XT22抗体 | Biolegend | 506331 | |
| 10X红细胞裂解液 | Biolegend | 420301 | |
| 抗小鼠CD16/32抗体 | Biolegend | 101301 | |
| 抗CD45-Pacific Blue抗体 | Biolegend | 103139 | |
| 抗CD45-FITC抗体 | Biolegend | 103107 | |
| 抗Ly6G-AF647抗体 | Biolegend | 127610 | |
| 抗F4/80-AF700抗体 | Biolegend | 123130 | |
| 抗CD206-AF647抗体 | Biolegend | 141712 | |
| 抗CD8-AF488抗体 | Biolegend | 100723 | |
| 抗小鼠TNF-α-BV785抗体 | Biolegend | 506341 | |
| 抗Myc-AF488抗体 | Cell Signaling | 2279 | |
| 微生物培养 | 卡那霉素 | -- | -- |
| 蛋白质表达 | L-阿拉伯糖 | -- | -- |
| 细菌工程 | 大观霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体筛选 | 噬菌体库多样性、筛选轮次、抗原浓度、酵母展示筛选的抗原浓度和FACS分选门 阅读提示：Materials and methods: Phage display selection, Yeast surface display library construction and selection |
| 内化实验 | 细胞系、TNF-α和抗体浓度、孵育温度和时间 阅读提示：Materials and methods: Temperature-dependent cell uptake assay |
| ADC/免疫毒素体外毒性 | 细胞系、ADC或免疫毒素浓度、TNF-α浓度、处理时间 阅读提示：Materials and methods: Cell viability assay |
| 细菌分泌与定植 | 菌株（Δlpp）、质粒、诱导剂IPTG浓度、瘤内注射剂量、检测时间点 阅读提示：Materials and methods: Construction of the BL21(DE3) Δlpp strain, Characterization of protein secretion from bacteria, Mouse experiments |
| 体内疗效 | 小鼠品系和性别、肿瘤细胞接种数量、细菌注射剂量和途径、肿瘤体积测量方法 阅读提示：Materials and methods: Mouse experiments |
| 免疫微环境分析 | 肿瘤消化酶浓度和时间、抗体克隆号、染色方案和分析门 阅读提示：Materials and methods: Mouse experiments (tumor-infiltrating leukocyte profiling) |