设计初始串联CAR构建体
验证IL13Rα2-B7-H3串联CAR能否在T细胞表面表达并杀伤肿瘤细胞。
设计并构建了串联CAR构建体C#1，包含IL13Rα2 scFv（clone 47）和B7-H3 scFv（MGA271），通过慢病毒转导至人T细胞，检测细胞内和细胞外Flag表达，并评估对Daoy细胞的杀伤。
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计算结构优化增强了IL13Rα2-B7-H3串联CAR T细胞以克服抗原异质性介导的肿瘤逃逸
Computational structural optimization enhances IL13Rα2 - B7-H3 tandem CAR T cells to overcome antigen-heterogeneity-mediated tumor escape
实验完整度
高包含细胞系体外功能实验（细胞毒性、ELISA）、多轮CAR构建体表达筛选、超分辨显微镜检测、体内异质性肿瘤模型实验及计算结构预测等多层级验证。
主要模型
人外周血T细胞 Daoy 细胞系（髓母细胞瘤） NSG 小鼠颅内肿瘤模型 Daoy 敲除细胞系及异质性混合肿瘤模型
重点核对
CAR 构建体设计（scFv 顺序、VH/VL 方向、连接子序列） 细胞表面表达效率（流式细胞术检测 Flag 标签细胞外表达） 体外细胞毒性（MTS 法，2:1 效靶比，24 小时） 体内抗肿瘤效果（NSG 小鼠颅内肿瘤模型，肿瘤注射量 3E4，T 细胞注射量 2E6）
摘要
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是治疗多种恶性肿瘤的高效方法。然而，一个局限性是肿瘤抗原的异质性和下调，这使得肿瘤细胞能够逃避传统的、单特异性的CAR T细胞。克服这种肿瘤逃逸的一种方法是利用识别两种抗原的串联CAR。然而，串联CAR构建体通常需要优化以实现细胞表面表达和功能。在此，我们描述了设计IL-13Rα2–B7-H3串联CAR的过程。有趣的是，我们最初的串联CAR未能表达在细胞表面，导致对24种在scFv定位、连接子和特定氨基酸上有所不同的串联构建体进行了系统评估。我们在CAR中发现了一个“问题区域”，并使用计算方法对其进行了优化，挽救了表面表达，并改善了与单特异性CAR T细胞相比的功能。此外，优化的串联CAR T细胞在体内比单特异性CAR T细胞更有效地消除了肿瘤。我们的研究证明了结构引导的计算策略成功应用于恢复IL13Rα2–B7-H3串联CAR的表面表达和抗肿瘤效力。我们的研究也强调了计算方法指导合成蛋白质设计的必要性，并且这些方法可以提高CAR T细胞的疗效。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 串联CAR T细胞能否通过计算结构优化克服抗原异质性介导的肿瘤逃逸，以及如何解决串联CAR表面表达失败的问题。
- 核心机制
- IL13Rα2 scFv VH 中的“问题区域”导致 CAR 分子胞内聚集，阻碍其表面表达；通过计算优化该区域（AbLIFT 多点突变）可恢复表达并增强功能。
- 主要证据
- 通过构建24种串联CAR变体，结合流式细胞术和MTS细胞毒性实验，定位“问题区域”于IL13Rα2 VH残基34-66；使用AlphaFold2和AbLIFT优化后，C#24恢复表面表达并在体外和体内（NSG小鼠）有效杀伤肿瘤。
- 研究意义
- 本研究展示了结构引导的计算策略在合成蛋白设计中的应用，有助于提高CAR T细胞的疗效，并可能推广至其他双特异性CAR设计。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
系统筛选串联CAR构建体
确定影响表面表达的关键因素（scFv顺序、方向、连接子）。
构建C#2至C#23，改变scFv顺序、VH/VL方向、连接子类型，通过流式细胞术检测表达，并用MTS法检测杀伤。
定位“问题区域”
通过缺失突变定位导致表面表达失败的IL13Rα2 scFv内具体区域。
构建C#9-C#19，逐步删除IL13Rα2 scFv的VH或VL的不同片段，检测表达和杀伤，最终将问题区域缩小至IL13Rα2 VH残基34-66。
计算优化和功能验证
通过计算结构预测和优化恢复串联CAR的表面表达，并验证其体外和体内功能。
使用AlphaFold2预测C#21结构，AbLIFT优化“问题区域”，选择C#24；验证其表达、杀伤、双抗原识别（ELISA）、体内抗肿瘤效果，并在异质性肿瘤模型中进行测试。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Cytiva | SH30022FS |
| 胎牛血清 | Gibco | A5670801 | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050079 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200056 | |
| IMDM培养基 | Gibco | 12-440-053 | |
| RPMI培养基 | Cytiva | SH30096.01 | |
| EMEM培养基 | ATCC | 30-2003 | |
| 支原体检测 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-318 |
| 克隆构建 | CutSmart缓冲液 | NEBiolabs | B7204S |
| 限制性内切酶NcoI | NEBiolabs | R3193S | |
| 限制性内切酶SphI | NEBiolabs | R3182S | |
| 限制性内切酶MluI | NEBiolabs | R3198S | |
| Ambion无核酸酶水 | Life Technologies Corp | AM9937 | |
| PCR | PrimeSTAR预混液 | Takara | ST1230 |
| 热循环仪 | Applied Biosystems | 4484073 | |
| 琼脂糖凝胶电泳 | 上样缓冲液 | New England BioLabs | B7024S |
| TAE缓冲液 | Invitrogen | 24710-030 | |
| 琼脂糖 | Sigma | A9539 | |
| SyberSafe染料 | Invitrogen | S33102 | |
| DNA纯化 | NucleoSpin凝胶和PCR纯化试剂盒 | Macherey-Nagel | 74060910 |
| 克隆构建 | In-Fusion Snap预混液 | Takara | ST2320 |
| Stellar感受态细胞 | Takara | ST0213 | |
| S.O.C.培养基 | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB肉汤 | Sigma-Aldrich | L7275 | |
| 质粒提取 | ZymoPURE II质粒中提试剂盒 | Zymo Research | D4201 |
| 病毒包装 | GeneJuice转染试剂 | Sigma-Aldrich | 70967-5 |
| OptiMEM培养基 | Gibco | 31-985-062 | |
| T细胞培养 | 抗CD3抗体 | Miltenyi Biotec | 130-093-387 |
| 抗CD28抗体 | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | |
| 白细胞介素-7 | Peprotech | 200-7 | |
| 白细胞介素-15 | Peprotech | 200-15 | |
| T细胞转导 | RetroNectin重组人纤连蛋白片段 | Takara | T100B |
| T细胞培养 | 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 14190144 |
| 流式细胞术 | Live Dead Aqua染料 | Invitrogen | L34966 |
| FoxP3/转录因子染色缓冲液套装 | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| 抗Flag抗体 | Biolegend | 637307 | |
| Live Dead Near-IR染料 | Invitrogen | L34975 | |
| 抗B7-H3抗体 | BD Biosciences | 565829 | |
| 抗IL13Rα2抗体 | Biolegend | 354403 | |
| 抗GD2抗体 | Biolegend | 357312 | |
| 抗HER2抗体 | Biolegend | 324414 | |
| 抗CD4抗体 | BD Biosciences | 563550 | |
| 抗CD8抗体 | Biolegend | 344732 | |
| 抗4-1BB抗体 | BD Biosciences | 561701 | |
| 抗CD25抗体 | BD Biosciences | 555431 | |
| 抗CD69抗体 | BD Biosciences | 563835 | |
| 抗PD-1抗体 | Biolegend | 329906 | |
| 抗LAG-3抗体 | Biolegend | 369308 | |
| 抗TIGIT抗体 | Biolegend | 372706 | |
| FACSCanto流式细胞仪 | BD | -- | |
| LSRFortessa X-20流式细胞仪 | BD | -- | |
| FlowJo软件 | FlowJo | -- | |
| 细胞毒性实验 | CellTiter96 Aqueous One Solution细胞增殖检测试剂盒 | Promega | G3581 |
| Tecan Infinite M Plex酶标仪 | Tecan | -- | |
| 显微镜成像 | 多聚赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P8920 |
| MemBrite Fix细胞表面染色试剂盒 | Biotium | 50-196-4511 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| 抗Lamp1抗体 | Abcam | AB25630 | |
| 抗小鼠AlexaFluor647抗体 | Invitrogen | A31571 | |
| 抗大鼠AlexaFluor568抗体 | Abcam | AB175475 | |
| Fluoromount封片剂 | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| Zeiss Lsm 980 Airyscan超分辨共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 显微镜图像分析 | Fiji软件 | -- | -- |
| 敲除细胞系构建 | Cas9蛋白 | QB3 MacroLab | -- |
| Neon转染系统及试剂盒 | Invitrogen | MPK1025 | |
| 重组蛋白刺激 | 重组B7-H3蛋白 | R&D Systems | 1027-B3 |
| 重组IL13Rα2蛋白 | R&D Systems | 7147-IR | |
| ELISA | 干扰素-γ ELISA试剂盒 | R&D Systems | SIF50 |
| 动物实验 | D-荧光素 | Revvity | 122799 |
| 活体成像系统 | Revvity | -- | |
| 基质胶 | Corning | 356234 | |
| 肿瘤组织分离 | 成体脑组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-107-677 |
| 肿瘤组织培养 | 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 |
| 庆大霉素 | Gibco | 15750060 | |
| 计算生物学 | AlphaFold2 | DeepMind | -- |
| AbLIFT | -- | -- | |
| FoldX | -- | -- | |
| Aggrescan | -- | -- | |
| Paratome | -- | -- | |
| Rosetta | -- | -- | |
| 克隆构建 | BioRender绘图工具 | BioRender | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CAR构建体设计 | scFv顺序、VH/VL方向、连接子序列、信号肽、铰链、跨膜域、共刺激域 阅读提示：Materials and methods: Generation of CAR construct plasmids; Figure 1和2 |
| T细胞培养与转导 | PBMC来源、抗CD3/CD28刺激浓度、IL-7和IL-15浓度、转导时间 阅读提示：Materials and methods: CAR T cell generation |
| 体外细胞毒性实验 | 效应细胞与靶细胞比例、共培养时间、靶细胞类型 阅读提示：Materials and methods: Cytotoxicity assay; Figure legends |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系、肿瘤细胞注射量、T细胞注射量、注射途径、肿瘤生长时间 阅读提示：Materials and methods: In vivo models and tumor harvest; Figure 5 |
| 计算优化 | AlphaFold2版本、AbLIFT设置、fitness score计算细节 阅读提示：Materials and methods: Computational optimization of the IL13Rα2 variable heavy chain |