分析RA患者T细胞中PDIA3表达
探究PDIA3在RA患者致病性CD4 T细胞中的表达变化及其与疾病严重性的关联。
利用RA患者PBMCs的bulk和scRNA-seq数据，分析PDIA3在T细胞亚群中的表达；并通过qRT-PCR和Western blot验证PDIA3在RA患者CD4 T细胞中的表达，以及其与CRP和DAS-28的相关性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
PDIA3通过作为分子伴侣促进STAT1和PKM2的非经典核输入来协调效应T细胞程序
PDIA3 orchestrates effector T cell program by serving as a chaperone to facilitate the non-canonical nuclear import of STAT1 and PKM2
实验完整度
高包含患者样本、细胞模型、动物模型及功能/机制验证，如RNA-seq、流式、ChIP、IP、体内实验等。
主要模型
RA患者CD4 T细胞及PBMCs 胶原诱导关节炎小鼠 CD4 T细胞特异性Pdia3敲除小鼠 Rag1-/-小鼠过继转移模型
重点核对
RA患者及健康对照的CD4 T细胞中PDIA3表达及与疾病活动度的相关性 CIA模型中NTZ给药剂量（200 mg/kg）及频率（每3天一次） Th1和Th17极化条件（IL-2、IL-12、IL-6、TGF-β浓度） PDIA3抑制剂TIZ的浓度（5 μM） Rag1-/-小鼠过继转移的细胞数量（1×10^6/只）
摘要
T细胞激活失调是类风湿关节炎（RA）免疫病理学的基础，然而协调T细胞效应程序的机制仍不完全清楚。在此，我们利用RA患者的bulk和单细胞RNA测序数据，并验证了蛋白二硫键异构酶A家族成员3（PDIA3）是一个潜在的治疗靶点。PDIA3在来自RA患者的致病性CD4 T细胞中显著上调，并与C反应蛋白水平和疾病活动评分28呈正相关。药理学抑制或遗传消融PDIA3可减轻RA相关的关节病理和自身免疫反应。机制上，T细胞受体信号触发细胞内钙流以激活NFAT1，该过程在RA环境下被Wnt5a进一步增强。激活的NFAT1随后直接结合Pdia3启动子以增强PDIA3的表达，PDIA3与STAT1或PKM2形成复合物，分别促进其核输入以转录辅助性T细胞1（Th1）和Th17谱系相关基因。这种非经典调控机制可能在病理条件下发生，因为PDIA3只能在异常外部刺激后被高度诱导。总之，我们的数据支持靶向PDIA3是临床上减轻自身免疫疾病（如RA）的重要策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PDIA3如何调控类风湿关节炎中的效应CD4 T细胞程序及其潜在机制。
- 核心机制
- TCR和Wnt5a信号协同激活Ca2+-NFAT1通路，NFAT1转录上调PDIA3，PDIA3作为分子伴侣与STAT1或PKM2结合，促进其核输入，从而增强Th1和Th17分化。
- 主要证据
- RA患者样本显示PDIA3高表达且与疾病严重度相关；Pdia3缺失或PDIA3抑制在CIA模型中减轻关节炎；体外实验证明PDIA3促进Th1/Th17极化；通过Co-IP、ChIP、荧光素酶报告基因等验证了机制。
- 研究意义
- 靶向PDIA3可能成为治疗RA及其他自身免疫疾病的潜在策略，且NTZ作为FDA批准的PDIA3抑制剂具有临床转化前景。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PDIA3缺失或抑制对CIA模型的影响
评估PDIA3在RA发展中的功能作用。
使用CD4 T细胞特异性Pdia3敲除小鼠和NTZ处理小鼠，诱导CIA模型，监测临床评分、关节肿胀、组织病理、血清细胞因子和T细胞亚群。
体外T细胞极化实验
确定PDIA3对CD4 T细胞分化为Th1和Th17的影响以及其内在作用。
分离WT和KO小鼠的初始CD4 T细胞，在Th1或Th17极化条件下培养，或加入PDIA3抑制剂TIZ，然后检测Th1/Th17细胞的频率和功能标志。
过继转移和感染模型
在体内验证PDIA3在T细胞效应功能中的内在作用。
将WT或KO小鼠的CD4 T细胞过继转移至Rag1-/-小鼠，诱导结肠炎，监测体重、结肠长度和组织学；或用OVA结合白色念珠菌感染WT和KO小鼠，分析抗原特异性T细胞反应。
研究PDIA3的上游调控机制
阐明TCR和Wnt5a信号如何调控PDIA3表达。
通过ChIP和荧光素酶报告基因验证NFAT1结合Pdia3启动子；使用recombinant Wnt5a、iNFAT1、EDTA和MSAB处理，检测PDIA3和NFAT1表达；用钙离子探针检测钙流。
鉴定PDIA3的下游效应分子
确定PDIA3调控Th1和Th17分化的靶蛋白。
通过RNA-seq分析Pdia3 KO和WT Th1/Th17细胞的差异表达基因；通过pull-down和质谱鉴定相互作用蛋白；通过Co-IP和分子对接确认PDIA3与STAT1和PKM2的相互作用。
验证PDIA3促进STAT1和PKM2核输入
验证PDIA3是否作为分子伴侣促进STAT1和PKM2入核。
在HEK293T细胞中过表达STAT1或PKM2突变体（活性/非活性）及PDIA3-WT或PDIA3-MUT，检测核内蛋白水平；在KO T细胞中转导相应逆转录病毒，检查Th1/Th17分化恢复情况。
评估NTZ/TIZ对PDIA3功能的影响
探索PDIA3抑制剂对核转位和与STAT1/PKM2相互作用的抑制作用。
用TIZ处理T细胞，通过共聚焦显微镜检测PDIA3、STAT1和PKM2的核定位，并用Co-IP检测TIZ对PDIA3与STAT1或PKM2相互作用的抑制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和极化 | 初始CD4 T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-453 |
| 重组小鼠IL-2 | BD Biosciences | 575404 | |
| 重组小鼠IL-12 | BD Biosciences | 577004 | |
| 重组小鼠IL-6 | BD Biosciences | 575706 | |
| 重组小鼠TGF-β | BD Biosciences | 763102 | |
| 替唑尼特 | Selleck | S5394 | |
| 硝唑尼特 | Selleck | S1627 | |
| Wnt5a | Design Gene Biotechnology | -- | |
| 抗CD3抗体 | BD Biosciences | 553057 | |
| 抗CD28抗体 | BD Biosciences | 553295 | |
| 细胞增殖实验 | CFSE细胞示踪染料 | Life Technologies | -- |
| Cell Trace Violet细胞示踪染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 流式分析 | BD Horizon固定活力染料780 | BD Biosciences | 565388 |
| 抗小鼠CD4抗体 | BD Biosciences | 100406 | |
| 抗小鼠IFN-γ抗体 | BD Biosciences | 505826 | |
| 抗小鼠IL-17A抗体 | BD Biosciences | 506926 | |
| 抗小鼠Foxp3抗体 | BD Biosciences | 126408 | |
| MACSQuant Analyzer 10流式细胞仪 | Miltenyi Biotec | -- | |
| RNA-seq | RNeasy离心柱试剂盒 | Qiagen | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| Illumina TruSeq链特异性mRNA LT文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| MiSeq测序系统 | Illumina | -- | |
| ChIP assay | 抗NFAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 4389 |
| 荧光素酶报告基因实验 | Lipofectamine 3000转染试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒 | Promega | -- | |
| 免疫印迹 | 抗PDIA3抗体 | Cell Signaling Technology | 2887 |
| 抗STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 14994 | |
| 抗磷酸化STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9167 | |
| 抗PKM2抗体 | Cell Signaling Technology | 4053 | |
| 抗磷酸化PKM2抗体 | Cell Signaling Technology | 3827 | |
| RIPA裂解液 | Servicebio | -- | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| ECL plus化学发光试剂 | Servicebio | -- | |
| CIA模型 | 鸡II型胶原 | Chondrex | 20011 |
| 完全弗氏佐剂 | Chondrex | 7001 | |
| ELISA | 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | Biolegend | -- |
| 小鼠IL-17A ELISA试剂盒 | Biolegend | -- | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Biolegend | -- | |
| 定量PCR | Trizol试剂 | Takara | -- |
| cDNA合成试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| ABI Prism 7500序列检测系统 | Applied Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PDIA3表达分析 | RA患者和健康对照的样本数量及临床特征；PDIA3表达检测方法（qRT-PCR/Western blot）；相关性分析所用的统计方法 阅读提示：参见Methods部分“Human samples”和“RNA extraction and quantitative PCR” |
| CIA模型 | 小鼠品系、年龄、性别；胶原免疫剂量和佐剂；NTZ给药剂量、频率和途径；临床评分标准和观察时间点 阅读提示：参见Methods部分“Collagen-induced arthritis mouse model”和“NTZ administration in collagen-induced arthritis mouse model” |
| 过继转移模型 | 供体和受体小鼠品系；细胞类型和数量；注射途径；监测指标和时间点 阅读提示：参见Methods部分“Adoptive transfer mouse model” |
| T细胞极化 | 初始CD4 T细胞分离方法；极化条件（细胞因子浓度、抗体浓度、培养时间）；抑制剂或重组蛋白的浓度 阅读提示：参见Methods部分“Cell isolation and in vitro polarization” |
| 机制研究 | ChIP实验的细胞数和抗体；荧光素酶报告基因构建和转染条件；蛋白质相互作用实验（Co-IP, pull-down）的条件；核蛋白提取方法 阅读提示：参见Methods部分“ChIP assay”、“Plasmid constructs and luciferase reporter assay”、“Pulldown mass spectrometry” |