筛选与鉴定PGK1负调控lncRNA
筛选出与PGK1负相关且具有良好临床结局的lncRNA，并验证其对PGK1的调控作用
利用TANRIC、Starbase和TCGA数据库筛选候选lncRNA，并在MCF-7和MDA-MB-231细胞中过表达候选lncRNA，检测PGK1蛋白和mRNA水平。
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FOXO3A诱导的LINC00926通过抑制PGK1介导的Warburg效应抑制乳腺肿瘤生长和转移
FOXO3A-induced LINC00926 suppresses breast tumor growth and metastasis through inhibition of PGK1-mediated Warburg effect
实验完整度
高涵盖数据库筛选、体外细胞功能与糖酵解检测、机制验证（泛素化、RNA pull-down、ChIP）及体内移植瘤和肺转移模型等多层级证据。
主要模型
MCF-7细胞系 MDA-MB-231细胞系 裸鼠皮下移植瘤模型 裸鼠尾静脉注射肺转移模型 109例人乳腺癌组织样本
重点核对
细胞系：MCF-7和MDA-MB-231 体内模型：BALB/c裸鼠皮下接种及尾静脉注射 缺氧处理：ZR-751、MDA-MB-231和MCF-7细胞暴露于常氧或低氧（0.5 h, 2 h, 6 h） MG132处理浓度：10 μM 每组动物数：肿瘤生长实验7或8只，转移实验6只
摘要
磷酸甘油酸激酶1（PGK1）是糖酵解通路的关键组分，与多种癌症的发生发展有关。然而，PGK1抑制的机制以及PGK1抑制剂在癌细胞中的生理意义尚不清楚。长链非编码RNA（lncRNA）在肿瘤生长和进展中发挥重要作用。在此，我们鉴定了一个lncRNA LINC00926，它负调控PGK1表达，并预示乳腺癌的良好临床结局。LINC00926通过增强E3连接酶STUB1介导的PGK1泛素化来下调PGK1表达。此外，缺氧主要通过FOXO3A抑制LINC00926表达并激活PGK1表达。FOXO3A/LINC00926/PGK1轴在体外和体内调节乳腺癌糖酵解、肿瘤生长和肺转移。在乳腺癌患者中，LINC00926表达与PGK1呈负相关，与FOXO3A表达呈正相关。我们的工作确立了FOXO3A/LINC00926/PGK1作为调节乳腺癌生长和进展的关键轴。靶向PGK1或补充LINC00926或FOXO3A可能成为乳腺癌的潜在治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LINC00926是否以及如何负调控PGK1表达，并影响乳腺癌糖酵解、生长和转移？
- 核心机制
- LINC00926通过增强E3连接酶STUB1介导的PGK1泛素化降解来抑制PGK1表达，进而抑制Warburg效应；缺氧通过减少FOXO3A对LINC00926启动子的招募来抑制LINC00926转录，从而激活PGK1。
- 主要证据
- 过表达LINC00926降低PGK1蛋白水平并抑制糖酵解、增殖、迁移和侵袭；敲低PGK1可逆转这些效应。机制上，RNA pull-down、RIP和泛素化实验证明LINC00926与STUB1和PGK1互作并促进PGK1泛素化。体内移植瘤和肺转移模型证实LINC00926抑制肿瘤生长和转移。
- 研究意义
- 该研究首次证明LINC00926通过抑制PGK1介导的Warburg效应抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移，并提示靶向PGK1或补充LINC00926或FOXO3A可能成为乳腺癌的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞功能验证
验证LINC00926对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解的影响
过表达或敲低LINC00926，通过CCK-8、克隆形成、划痕愈合、Transwell侵袭实验检测细胞功能；通过葡萄糖摄取、乳酸、ATP生成、ECAR和OCR检测糖酵解水平。
机制解析：LINC00926调控PGK1蛋白稳定性
阐明LINC00926下调PGK1蛋白表达的分子机制
通过RNA pull-down、RIP、Co-IP和泛素化实验，验证LINC00926与STUB1和PGK1的相互作用及其对PGK1泛素化降解的影响。
上游调控：缺氧通过FOXO3A抑制LINC00926表达
探究缺氧抑制LINC00926表达的分子机制
检测缺氧条件下LINC00926和PGK1的表达变化，通过荧光素酶报告基因、ChIP实验验证FOXO3A对LINC00926启动子的调控。
体内功能验证
验证FOXO3A/LINC00926/PGK1轴对乳腺癌生长和肺转移的影响
将稳定表达相关构建体的MDA-MB-231细胞皮下接种或尾静脉注射至裸鼠，测量肿瘤体积，并通过CT扫描和组织学分析评估肺转移。
临床样本相关性分析
验证LINC00926、PGK1和FOXO3A在乳腺癌患者中的表达相关性及其临床意义
通过IHC和FISH检测109例乳腺癌组织中PGK1、FOXO3A和LINC00926的表达，并进行相关性分析；结合18FDG PET扫描评估葡萄糖摄取。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 载体构建 | pcDNA3.0载体 | Invitrogen | -- |
| pGL3-Basic载体 | Promega | -- | |
| pCDH载体 | System Biosciences | -- | |
| pSIH-H1-Puro载体 | System Biosciences | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Life Technologies | -- |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | -- | |
| Western blot | PGK1抗体 | Proteintech | 17811-1-AP |
| β-actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green染料 | BioRad | -- |
| CFX96系统 | BioRad | -- | |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒（CCK-8） | Dojindo | -- |
| 细胞侵袭 | Matrigel侵袭小室 | BD Biosciences | -- |
| 糖酵解检测 | 葡萄糖摄取比色分析试剂盒 | Biovision | -- |
| 乳酸检测试剂盒II | Biovision | -- | |
| ATP比色分析试剂盒 | Biovision | -- | |
| 代谢分析 | Seahorse XFe 96细胞外通量分析仪 | Agilent | -- |
| Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent | -- | |
| Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | -- | |
| 细胞实验 | 寡霉素 | -- | -- |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | -- | -- | |
| 鱼藤酮 | -- | -- | |
| MG132 | -- | -- | |
| RNA pull-down | 生物素RNA标记混合物 | -- | -- |
| T7 RNA聚合酶 | -- | -- | |
| 链霉亲和素磁珠 | MCE | -- | |
| ChIP | Magna ChIP G检测试剂盒 | Millipore | -- |
| FISH | Ribo FISH试剂盒 | RiboBio | C10910 |
| IHC | Ki67抗体 | Servicebio | GB13030-2 |
| FOXO3A抗体 | Proteintech | 66428-1-Ig | |
| 显微镜 | 倒置显微镜（TE2000） | Nikon | -- |
| 荧光或共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| 统计分析 | SPSS v.23.0 | IBM | -- |
| Prism GraphPad 8.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：MCF-7, T47D, ZR75-1, MDA-MB-453, MDA-MB-231；培养基：DMEM+10% FBS；培养条件：37°C、5% CO2 阅读提示：Materials and methods: Cell lines, plasmids, lentivirus, RNA oligonucleotides, and regents |
| 体外功能实验 | 转染试剂：Lipofectamine 2000 和 Lipofectamine RNAiMAX；质粒：LINC00926、PGK1表达载体、siRNA/shRNA；细胞密度：CCK-8每孔3000细胞；克隆形成2周；划痕实验使用200 μL枪头；侵袭实验使用Matrigel小室 阅读提示：Materials and methods: Cell growth, migration, and invasion assays |
| 糖酵解检测 | 试剂盒：Glucose Uptake Colorimetric Assay kit、Lactate Assay Kit II、ATP Colorimetric Assay kit；细胞密度：1×10^6细胞/孔；葡萄糖饥饿处理：KRPH缓冲液+2% BSA, 40分钟；2-DG: 10 mM, 20分钟；Seahorse实验：1×10^4细胞/孔 阅读提示：Materials and methods: Glucose uptake, lactate, and ATP assay; Extracellular acidification and OCR assays |
| 机制实验 | MG132浓度：10 μM；RNA pull-down使用生物素标记LINC00926和链霉亲和素磁珠；RIP使用抗PGK1和STUB1抗体；泛素化实验使用Myc-Ubi、HA-Ubi和FLAG-PGK1 阅读提示：Materials and methods: RNA pull-down and mass spectrometry analysis; Results: LINC00926 regulates PGK1 protein stability |
| 体内实验 | 动物品系：BALB/c裸鼠；细胞接种量：皮下1×10^7，尾静脉1×10^6；动物数量：肿瘤生长n=7或8，转移n=6；成瘤时间约40天 阅读提示：Materials and methods: Analysis of tumor growth and metastasis in vivo |
| 临床样本 | 样本量：109例乳腺癌；IHC检测PGK1、FOXO3A；FISH检测LINC00926；统计分析：Spearman相关、Mann Whitney U检验 阅读提示：Materials and methods: Tissue samples and IHC; Results: Correlation between LINC00926 and PGK1 expression |