SNHG11在胃癌中的表达及预后分析
筛选并验证SNHG11在胃癌中的异常表达及其与患者预后的关系。
利用lncRNA PCR阵列筛选差异表达lncRNA，采用qRT-PCR验证SNHG11在胃癌组织和细胞系中的表达，结合Kaplan-Meier生存分析评估预后意义。
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lncRNA SNHG11通过激活Wnt/β-catenin通路和致癌自噬促进胃癌进展
lncRNA SNHG11 Promotes Gastric Cancer Progression by Activating the Wnt/β-Catenin Pathway and Oncogenic Autophagy
实验完整度
高包含细胞功能实验、分子机制实验（ceRNA、pre-miRNA加工、泛素化）、体内异种移植及转移模型等多层级验证。
主要模型
胃癌细胞系（SGC-7901、MKN-45、AGS等） 正常胃上皮细胞系GES-1 BALB/c裸鼠异种移植模型 胃癌患者组织样本
重点核对
SNHG11在胃癌细胞系（SGC-7901、MKN-45）中的敲低效率（sh/SNHG11#1/2） SNHG11调控Wnt/β-catenin通路活性（TOP/FOP flash assay）及核β-catenin水平 SNHG11与miR-483-3p/miR-1276的相互作用及对CTNNB1/ATG12的靶向调控 SNHG11与CUL4A的相互作用及对GSK-3β泛素化的影响 体内实验中SNHG11对肿瘤生长和转移的影响（皮下异种移植和尾静脉转移模型）
摘要
长链非编码RNA（lncRNA）在包括胃癌（GC）在内的癌症发展中的作用正被积极研究。致癌自噬是癌细胞存活所必需的。本研究旨在探讨lncRNA小核仁RNA宿主基因11（SNHG11）在GC中的调控作用。我们发现SNHG11在GC中上调，且其上调与患者不良预后相关。功能上，SNHG11通过促进致癌自噬来促进GC细胞的增殖、干性、迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）。机制上，SNHG11通过miR-483-3p/miR-1276在转录后水平上调连环蛋白β1（CTNNB1）和自噬相关蛋白12（ATG12），而SNHG11阻碍前体（pre-）miR-483/pre-miR-1276的加工。SNHG11通过与Cullin 4A（CUL4A）相互作用诱导GSK-3β泛素化，进一步激活Wnt/β-catenin通路。有趣的是，SNHG11以依赖于ATG12而非Wnt/β-catenin通路的方式调控自噬，而SNHG11通过这两条通路促进GC细胞的恶性行为。最后，SNHG11在GC细胞中的上调被证明是由TCF7L2转录诱导的。总之，我们揭示SNHG11是GC中的一种致癌lncRNA，可能是GC一个有前景的预后和治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SNHG11在胃癌中的表达、功能及分子机制是什么？
- 核心机制
- SNHG11通过miR-483-3p/miR-1276调控CTNNB1和ATG12，并与CUL4A相互作用诱导GSK-3β泛素化，激活Wnt/β-catenin通路和致癌自噬，促进胃癌进展。
- 主要证据
- 通过细胞增殖、干性、迁移侵袭、自噬检测、TOP/FOP flash、RNA pull-down、RIP、泛素化分析和体内异种移植模型，证实SNHG11通过上述机制发挥作用。
- 研究意义
- SNHG11可作为胃癌的预后生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SNHG11对胃癌细胞增殖、干性、迁移侵袭和自噬的体外功能分析
检测SNHG11对胃癌细胞恶性表型及自噬的影响。
通过shRNA敲低和过表达SNHG11，利用CCK-8、集落形成、EdU、成球实验、流式细胞术、Transwell、免疫荧光和Western blot检测相关表型变化。
SNHG11调控Wnt/β-catenin通路的分子机制
阐明SNHG11激活Wnt/β-catenin通路的具体分子机制。
通过TOP/FOP flash assay、亚细胞分离、RNA pull-down、RIP、免疫共沉淀及泛素化实验，验证SNHG11作为ceRNA及与CUL4A相互作用调控GSK-3β的机制。
SNHG11调控自噬的分子机制
探究SNHG11是否通过miR-483-3p/miR-1276/ATG12轴调控自噬。
通过双荧光素酶报告基因、RIP、Western blot和自噬流检测，验证SNHG11通过miR-483-3p/miR-1276上调ATG12从而促进自噬。
SNHG11的转录调控机制
阐明SNHG11在胃癌细胞中上调的转录调控机制。
通过ChIP、双荧光素酶报告基因及pull-down实验，证实转录因子TCF7L2直接结合SNHG11启动子并激活其转录。
SNHG11在体内对胃癌生长和转移的影响
在体内验证SNHG11通过Wnt/β-catenin通路和自噬促进胃癌进展。
通过皮下异种移植和尾静脉转移模型，结合LiCl、Rapa及anti-miRNA和si-GSK-3β等处理，评估SNHG11对肿瘤生长和转移的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | EvoScript通用cDNA合成预混液 | Roche | -- |
| rtStar第一链cDNA合成试剂盒 | Arraystar | AS-FS-001 | |
| qPCR | Arraystar SYBR Green实时荧光定量PCR预混液 | Arraystar | AS-MR-005 |
| TaqMan miRNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| TaqMan miRNA检测试剂 | Applied Biosystems | -- | |
| LightCycler 480 PCR仪 | Roche | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| ECL化学发光试剂 | Pierce | -- | |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| EdU标记/检测试剂盒 | Ribobio | -- | |
| ELx800酶标仪 | BioTek | -- | |
| 成球实验 | DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| B27添加剂 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| Annexin V-FITC/PI染色 | -- | -- | |
| CD133-PE抗体 | Miltenyi Biotec | -- | |
| Transwell实验 | Matrigel基质胶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞黏附 | 纤连蛋白 | Sigma | 10838039001 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7030 | |
| 结晶紫 | Solarbio | G1062 | |
| FISH | QuantiGene ViewRNA miRNA原位杂交细胞检测试剂盒 | Affymetrix | -- |
| 自噬流检测 | GFP-mRFP-LC3腺病毒载体 | HanBio Technology | -- |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | -- | |
| 报告基因 | TOP-flash报告基因 | Millipore | 17-285 |
| FOP-flash报告基因 | Millipore | 17-285 | |
| pSV40-Renilla质粒 | Promega | E6911 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | e1910 | |
| ChIP | MagnaChIP试剂盒 | Millipore | -- |
| RIP | Magna RIP试剂盒 | Millipore | -- |
| RNA pull-down | 生物素RNA标记混合液 | Roche | -- |
| T7 RNA聚合酶 | Roche | -- | |
| 无RNase的DNase I | Roche | -- | |
| 链霉亲和素琼脂糖珠 | Life Technologies | -- | |
| SilverQuest银染试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | LC6070 | |
| 质谱分析 | 液相色谱-质谱联用仪 | Shimadzu | -- |
| 免疫共沉淀 | Thermo Scientific Pierce Classic免疫沉淀试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 药物处理 | 雷帕霉素 | Selleck Chemicals | S1039 |
| 巴弗洛霉素A1 | Sigma-Aldrich | B1793 | |
| MG132蛋白酶体抑制剂 | -- | -- | |
| 氯化锂 | -- | -- | |
| Western blot | 兔抗Bcl2抗体 | Wanlei Biotechnology | WL01556 |
| 兔抗β-catenin抗体 | Wanlei Biotechnology | WL0962a | |
| 兔抗p62抗体 | ABclonal | A0682 | |
| 兔抗LC3II抗体 | ABclonal | A7198 | |
| 兔抗β-actin抗体 | Abcam | ab8227 | |
| 小鼠抗GSK-3β抗体 | Cell Signaling Technology | 9832 | |
| 兔抗TCF7L2抗体 | Cell Signaling Technology | 2569 | |
| 兔抗ATG12抗体 | Abcam | ab155589 | |
| 兔抗CUL4A抗体 | Abcam | ab72548 | |
| RIP | 抗Ago2抗体 | Abcam | ab32381 |
| 抗IgG抗体 | Abcam | ab190475 | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | -- | -- |
| 细胞培养 | GES-1、SGC7901、BGC823、MGC-803、MKN45、HGC27、AGS细胞系 | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | -- |
| HEK293T细胞 | American Type Culture Collection (ATCC) | -- | |
| 细胞转染 | pcDNA3.1载体 | Shanghai GenePharma | -- |
| pLKO.1载体 | Shanghai GenePharma | -- | |
| miRNA模拟物和抑制剂 | Shanghai GenePharma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（GES-1、SGC-7901、MKN-45等）、培养基（RPMI 1640/DMEM）、血清浓度（10% FBS）、培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods - Cell Lines and Cell Culture |
| 细胞转染 | 转染试剂（Lipofectamine 3000）、质粒（sh/SNHG11、pcDNA3.1/SNHG11等）及浓度、转染时间 阅读提示：Materials and Methods - Cell Transfection |
| 药物处理 | Rapa、BafA1、LiCl、MG132、CHX的处理浓度和时间 阅读提示：Materials and Methods - Cell Proliferation Assay, IP and Ubiquitination Assays |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠）、年龄（4-6周）、注射细胞量、肿瘤测量时间、实验周期 阅读提示：Materials and Methods - Animal Experiments |
| 分子实验 | RIP、pull-down、ChIP、双荧光素酶报告基因等实验的具体条件，如抗体、磁珠、裂解液等 阅读提示：Materials and Methods - ChIP, RIP, and Pull-Down Assay |