患者队列建立与临床评估
收集携带SF1变异的个体，描述其神经发育障碍表型。
通过GeneMatcher平台建立15名无关个体组成的队列，收集临床和遗传信息，进行外显子组或全基因组测序鉴定SF1变异，并评估其神经发育特征。
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剪接因子SF1的杂合致病性变异导致广泛的神经发育障碍
Heterozygous pathogenic variants in the splicing factor SF1 lead to a large spectrum of neurodevelopmental disorders
实验完整度
高包含患者队列临床遗传分析、胎儿脑及类器官表达谱、NPC敲低转录组与剪接分析、患者成纤维细胞RNA-seq验证等多层级证据。
主要模型
人类诱导多能干细胞（hiPSC）来源的背侧前脑类器官 皮质神经祖细胞（NPCs） 患者成纤维细胞 胎儿脑组织（单核RNA-seq数据）
重点核对
SF1敲低效率：siRNA转染后SF1 mRNA和蛋白水平显著降低 RNA-seq分析中差异表达基因和差异剪接事件的阈值（FC ≥ 1.5，pAdj ≤ 0.05；PSI变化≥30%） 患者队列：15名携带SF1新生变异的个体，临床表型包括神经发育障碍、自闭症特征等 类器官分化时间点（第30、50、90、120、200天）及SF1表达定位
摘要
可变剪接在大脑中高度普遍，协调着神经发生和突触发生等关键过程，这两者对于神经系统的复杂性和可塑性至关重要。剪接失调日益与神经发育障碍相关联。在此，我们描述了携带SF1（剪接因子1）新生、可能有害的杂合变异的不相关个体，他们均表现为严重程度不一的神经发育障碍，常伴有自闭症特征和其他非特异性表现。SF1是前体mRNA加工的核心组成部分，在3'剪接位点促进早期剪接体组装并调节可变剪接。我们在神经祖细胞中进行了功能研究，结果显示SF1下调改变了基因表达和可变剪接程序，特别是在涉及神经元分化、突触传递和轴突导向的基因中，这些过程对大脑发育至关重要。总之，这些发现将SF1功能障碍确定为导致神经发育障碍的一种额外剪接体病，并强调其在人类神经发育和疾病中的重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SF1基因的杂合变异是否与神经发育障碍相关，以及SF1在神经发育中的功能是什么？
- 核心机制
- SF1通过调控神经发育相关基因（如突触功能、轴突导向相关基因）的可变剪接和基因表达，影响神经祖细胞的转录和剪接程序，从而参与神经发育。
- 主要证据
- 在神经祖细胞中敲低SF1导致596个基因差异表达和599个基因差异剪接，这些基因富集于神经元分化、突触传递和轴突导向等过程；同时，患者成纤维细胞中观察到部分差异剪接事件。
- 研究意义
- 该研究确定SF1为常染色体显性神经发育性剪接体病的致病基因，扩展了剪接体病的范畴，并强调了SF1在人类神经发育中的关键作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SF1表达模式分析
确定SF1在人类胎儿脑和类器官中的表达分布。
分析公开的单核RNA-seq数据（孕17-41周）和自产的类器官scRNA-seq数据，并通过免疫荧光验证SF1蛋白在不同发育阶段的表达。
神经祖细胞中SF1敲低
探究SF1缺失对神经祖细胞基因表达和可变剪接的影响。
在皮质NPCs中通过siRNA敲低SF1，24小时后提取RNA和蛋白，进行转录组和剪接分析，并用RT-qPCR和Western blot验证敲低效率。
转录组和剪接分析
鉴定SF1调控的差异表达基因和差异剪接事件，并确认其功能富集。
对siCTRL和siSF1 NPCs进行RNA-seq，使用多种方法（EXON PSI, EXON SI, PATTERN, JUNCTION PAIR）分析差异剪接，进行GO和通路富集分析。
患者成纤维细胞验证
验证SF1变异对剪接的影响是否在患者样本中体现。
对来自3名患者的成纤维细胞进行RNA-seq，分析预先在NPCs中鉴定的外显子盒式剪接事件。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| hiPSC培养 | Geltrex无LDEV、hESC级、低生长因子基底膜基质 | Gibco | A1413301 |
| mTeSR Plus基础培养基 | STEMCELL Technologies | 100-0276 | |
| ReLeSR | STEMCELL | 100-0483 | |
| 细胞解离 | StemPro Accutase细胞解离试剂 | Gibco | A1110501 |
| 类器官生成 | AggreWell-800 | STEMCELL | 34815 |
| ROCK抑制剂Stemgent hES细胞克隆与恢复补充剂 | Ozyme | 01-0014-500 | |
| TeSR-E6 | STEMCELL | 05946 | |
| SB-431542 | STEMCELL | 53633 | |
| Neurobasal-A培养基 | Thermo Fisher Scientific | 10888022 | |
| 不含维生素A的B-27补充剂50× | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| 人重组表皮生长因子 | STEMCELL | 78136 | |
| 成纤维细胞生长因子 | STEMCELL | 78134.1 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Neurobasal Plus培养基 | Thermo Fisher Scientific | A3582901 | |
| B-27 Plus补充剂(50×) | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| 人重组BDNF，ACF | STEMCELL | 78133 | |
| 人/小鼠重组NT-3 | STEMCELL | 78074 | |
| NPC培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | A4192001 |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
| 多聚鸟氨酸溶液 | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| siRNA转染 | ON-TARGETplus人SF1 siRNA | Dharmacon | -- |
| ON-TARGETplus非靶向siRNA池 | Dharmacon | -- | |
| siGLO亲环蛋白B对照siRNA | Dharmacon | -- | |
| DharmaFECT 1转染试剂 | Dharmacon | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836170001 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | 4906845001 | |
| Western blot | Pierce去污剂兼容Bradford检测试剂盒 | Thermo Fisher | 23246 |
| Pierce LDS样品缓冲液 | Thermo Fisher | 84788 | |
| BOLT 4%-12% Bis-Tris凝胶 | -- | -- | |
| iBlot 2系统 | Invitrogen | IB21001 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Pierce ECL底物 | Thermo Fisher | 32209 | |
| ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RNA提取 | NucleoSpin RNA提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 740955.50 |
| Maxwell RSC简单RNA血液试剂盒 | Promega | AS1380 | |
| RNA-seq | Illumina链特异性mRNA_PrepLigation试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| Nextseq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| 单细胞RNA-seq | ASTERIA单细胞RNA-seq试剂盒 | Scipio Bioscience | 001-1000 |
| RT-qPCR | Verso cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AB1453A |
| SYBR Green PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4312704 | |
| 免疫荧光 | Epredia Richard-Allan Scientific Neg-50冷冻包埋剂 | Thermo Scientific | 6502G |
| 马血清 | Thermo Fisher Scientific | H1270 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | T9284-100ML | |
| DAPI | -- | -- | |
| Aquapolymount封片剂 | Polysciences | 18606 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hiPSC培养与类器官生成 | hiPSC系来源（WTSIi021-B和WTSIi008-A）、培养条件（Geltrex基质、mTeSR Plus培养基）、类器官生成步骤（AggreWell-800、SB-431542和dorsomorphin） 阅读提示：Methods: hiPSC culture and maintenance; Generation of dorsal forebrain organoids from hiPSCs |
| Cortical NPC生成与转染 | NPC系来源（来源于两个hiPSC系）、siRNA序列和浓度（0.25 μM）、转染试剂（DharmaFECT 1）、敲低时间（24小时） 阅读提示：Methods: Cortical NPC generation from DFOs; siRNA transfection of NPCs |
| RNA-seq与差异表达分析 | RNA提取试剂盒、文库制备方法、测序平台和参数、差异表达基因阈值（FC ≥ 1.5, pAdj ≤ 0.05） 阅读提示：Methods: Library preparation and RNA-seq; Bulk RNA-seq data analysis |
| 可变剪接分析 | 四种剪接分析方法（EXON PSI, EXON SI, PATTERN, JUNCTION PAIR）及其显著阈值（p ≤ 0.05, FC ≥ 1.5/2.0, delta PSI ≥ 30%） 阅读提示：Methods: Bulk RNA-seq data analysis; Figure legends 5 |
| 患者成纤维细胞RNA-seq | 患者样本（individuals 6, 12, 13）和对照数量、RNA提取试剂盒、测序平台、分析的剪接事件列表 阅读提示：Methods: RNA extraction; Analysis of RNA-seq data from individuals |