portimine A和B的全合成
建立可扩展的合成路线，以获得足够量的portimine A和B用于生物学研究。
采用两相合成策略，通过Diels-Alder反应、RCAM大环化、选择性氧化和还原等步骤，实现了portimine A和B的全合成，并修正了portimine B的结构。
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Porthimines的合成揭示了其抗癌活性的基础
Synthesis of portimines reveals the basis of their anti-cancer activity
实验完整度
高包含化学合成、体外细胞活性测定、体内肿瘤模型、化学蛋白质组学靶点鉴定及机制验证等多个独立实验层级。
主要模型
Jurkat细胞系 MC38小鼠结肠癌细胞系 HT-1080人纤维肉瘤细胞系 MC38同基因小鼠肿瘤模型 HT-1080异种移植瘤模型
重点核对
portimine A对多种癌细胞系的IC50值（0.55-5.6 nM） PA-DA光亲和探针标记NMD3，并被过量PA竞争 NMD3敲低后portimine A的细胞毒性降低 PA处理导致80S单体和二体积累，多聚体形成受阻 PA处理抑制新蛋白质合成
摘要
海洋来源的环状亚胺毒素，portimine A和B，因其引人入胜的化学结构和有前景的抗癌治疗潜力而受到广泛关注1-4。然而，目前无法获得大量样品，其强效活性背后的分子机制尚不清楚。为了解决这一问题，我们提出了一种可扩展的、简洁的portimines合成方法，该方法受益于两相萜类合成5,6的逻辑，以及利用环-链互变异构和骨架重排等独特策略，通过“自我保护”最大限度地减少保护基团化学。至关重要的是，这种全合成使得portimine B的结构重新分配成为可能，并对portimine A进行了深入的功能评估，揭示其以高效力选择性诱导人癌细胞系凋亡，并在体内肿瘤清除模型中有效。最后，实际合成portimines及其类似物简化了光亲和类似物的开发，这些类似物用于化学蛋白质组学实验，以确定portimine A的主要靶标为60S核糖体输出蛋白NMD3。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Portimine A的抗癌活性机制是什么？其分子靶标是什么？
- 核心机制
- Portimine A通过靶向NMD3，阻断多聚体形成，抑制蛋白质翻译，从而导致细胞周期阻滞和凋亡。
- 主要证据
- 化学蛋白质组学鉴定NMD3为唯一靶标；CETSA验证直接结合；NMD3敲低降低PA敏感性；多糖体分析显示80S积累和多聚体阻断；OPP实验证实翻译抑制。
- 研究意义
- 本研究提供了portimine A的可扩展合成路线，并首次鉴定了NMD3为其小分子配体，为开发新型抗癌药物提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞活性评估
评估portimine A及其类似物对多种癌细胞系和正常细胞的毒性及选择性。
测定了portimine A对20种人/鼠癌细胞系的IC50，并检测了其对Jurkat细胞的凋亡诱导、细胞周期阻滞作用，以及对PBMCs的毒性。
体内抗肿瘤效果评估
验证portimine A在动物模型中的肿瘤生长抑制效果和耐受性。
在MC38同基因小鼠模型和HT-1080异种移植瘤模型中，给予portimine A（0.3或1 mg/kg，腹腔注射），监测肿瘤生长和生存期。
靶点鉴定
利用化学蛋白质组学鉴定portimine A的分子靶标。
使用光亲和探针PA-DA和ePA-DA，结合TMT定量蛋白质组学，在多种细胞系中鉴定PA的靶标。
靶点验证
验证NMD3为portimine A的直接靶标，并确认其功能相关性。
通过免疫印迹验证PA-DA与内源NMD3的结合，使用CETSA评估配体诱导的热稳定，并检测NMD3敲低后细胞对PA敏感性的变化。
机制研究
阐明portimine A结合NMD3后如何导致细胞凋亡。
通过多糖体分析检测核糖体分布，使用OPP实验评估蛋白质合成速率，并检测下游蛋白c-Myc和Mcl-1的表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Corning | -- |
| DMEM培养基 | Corning | -- | |
| 胎牛血清 | Corning | -- | |
| 病毒转导 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| PBMC分离 | Lymphoprep淋巴细胞分离液 | STEMCELL Technologies | -- |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7570 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC | Abcam | ab14085 |
| 可固定活力染料eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | Thermo Fisher Scientific | P3566 |
| 凋亡救援实验 | Z-VAD-FMK | InvivoGen | -- |
| 免疫印迹 | 抗NMD3抗体 | Proteintech | 16060-1-AP |
| 抗eIF6抗体 | Proteintech | 10291-1-AP | |
| 抗PARP-1抗体 | Proteintech | 66520-1-Ig | |
| 抗RPS6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| 抗CASP3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| 抗Mcl-1抗体 | Cell Signaling Technology | 5453 | |
| 抗c-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 9402 | |
| 罗丹明标记的抗微管蛋白抗体 | Bio-Rad | 12004165 | |
| GAPDH hFAB抗体 | Bio-Rad | 12004168 | |
| 肌动蛋白hFAB抗体 | Bio-Rad | 12004164 | |
| 蛋白质组学 | 生物素-PEG3-叠氮化物 | Click Chemistry Tools | AZ104 |
| 翻译抑制实验 | O-炔丙基嘌呤霉素 | Click Chemistry Tools | 1407 |
| 蛋白质组学 | AZDye 488叠氮化物 | Click Chemistry Tools | 1275 |
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010 | |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| Pierce链霉亲和素琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Pierce高pH反相分级试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 84868 | |
| TMT10plex等压标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 90406 | |
| TMTpro 16plex标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A44520 | |
| 细胞裂解 | Halt蛋白酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 78438 |
| 细胞周期分析 | 核糖核酸酶A | Thermo Fisher Scientific | R1253 |
| 多糖体分析 | RiboLock RNA酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | EO0381 |
| 蛋白质组学 | 三(2-羧乙基)膦 | -- | -- |
| 三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺 | -- | -- | |
| 硫酸铜 | -- | -- | |
| 链霉亲和素琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| 三乙基碳酸氢铵 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | Promega | -- | |
| 羟胺 | -- | -- | |
| 甲酸 | -- | -- | |
| Orbitrap Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| UltiMate 3000 RSLCnano系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acclaim PepMap 100预柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acclaim PepMap RSLC分析柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | Neurobasal-A培养基 | Gibco | -- |
| N2添加剂 | Gibco | -- | |
| B27添加剂 | Gibco | -- | |
| Glutamax | Gibco | -- | |
| 抗真菌抗生素 | Life Tech | -- | |
| 人成纤维细胞生长因子 | R&D | -- | |
| 人表皮生长因子 | R&D | -- | |
| 多聚-D-赖氨酸 | Sigma | -- | |
| 层粘连蛋白 | Gibco | -- | |
| 病毒感染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences Inc | -- |
| 细胞培养 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- |
| 蛋白质组学 | DC蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| CLARIOstar酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 光亲和标记 | UVP交联仪 | Analytik Jena | -- |
| 蛋白质印迹 | PVDF膜 | -- | -- |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Image Lab软件 | Bio-Rad | -- | |
| 流式细胞术 | NovoCyte分析仪 | ACEA Biosciences | -- |
| FlowJo 10.8.0软件 | BD Biosciences | -- | |
| PCR | iScript RT-qPCR样本制备试剂 | Bio-Rad | 1708898 |
| Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒（含dsDNase） | Thermo Fisher Scientific | K1682 | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| QuantStudio 6 Pro实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 动物实验 | C57BL/6小鼠 | Jackson Laboratories | -- |
| 裸鼠 | Jackson Laboratories | 002019 | |
| 蛋白质组学 | Proteome Discoverer 2.4软件 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力检测 | 细胞系、处理时间、药物浓度范围 阅读提示：Methods 中 Proliferation assay 部分 |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系、性别、周龄、肿瘤细胞注射量、给药剂量及频率、肿瘤体积测量方法 阅读提示：Methods 中 Mouse tumor xenograft studies 部分 |
| 化学蛋白质组学 | 探针浓度（PA-DA/ePA-DA 500 nM）、竞争剂浓度（PA/ePA 4 μM）、UV照射条件（365 nm，20分钟）、细胞类型 阅读提示：Methods 中 Photoaffinity probe cell treatments 和 Preparation of samples for chemoproteomic analysis 部分 |
| 靶点验证（CETSA） | 处理浓度（PA 100 nM）、处理时间、温度梯度 阅读提示：Methods 中 Thermo stability experiments 部分 |
| NMD3敲低实验 | shRNA序列、转导方法、筛选浓度、PA处理浓度及时间 阅读提示：Methods 中 shRNA、Lentivirus production and transduction 和 Proliferation assay 部分 |
| 多糖体分析 | 细胞数量、PA浓度（50 nM）、处理时间（6小时）、环己酰亚胺浓度（100 μg/ml） 阅读提示：Methods 中 Sucrose gradient profiling 部分 |
| OPP翻译抑制实验 | 细胞类型、PA处理时间（6或18小时）、OPP浓度（5 mM）、脉冲时间（60分钟） 阅读提示：Methods 中 O-propargyl-puromycin (OPP) translation inhibition assay 部分 |