DGAT途径破坏与TAG合成缺失模型构建
验证DGAT1/2在TAG合成中的作用，并建立DGAT非依赖性筛选模型。
使用DGAT1/2抑制剂处理HAP1细胞验证TAG水平下降；通过CRISPR/Cas9敲除DGAT1和DGAT2，构建DGAT DKO细胞系，并验证其对油酸诱导的脂滴积累的抵抗性。
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鉴定一种替代的甘油三酯生物合成途径
Identification of an alternative triglyceride biosynthesis pathway
实验完整度
高文献包含单倍体遗传筛选、细胞功能验证（脂滴、TLC、脂质组学）、生化验证（交联、免疫共沉淀、无细胞酰化）、异源表达（大肠杆菌）及小鼠体内敲除模型，多个独立证据层级支持结论。
主要模型
HAP1单倍体细胞系 DGAT双敲除（DKO）及DIESL/TMX1敲除的HAP1细胞 大肠杆菌BL21 DIESL基因敲除小鼠
重点核对
TMX1缺失或DGAT抑制条件 DIESL活性位点H130A突变 脂质饥饿或脂蛋白缺乏条件 大肠杆菌中pelB信号肽介导的DIESL表达 小鼠出生后2-4周快速生长期
摘要
三酰甘油（TAG）是体内主要的能量储存来源，为线粒体β-氧化提供重要的底物库。TAG量的失衡与肥胖、心脏病及其他多种病理相关1,2。在人类中，TAG由二酰甘油O-酰基转移酶（DGAT1和DGAT2）从过剩的、辅酶A偶联的脂肪酸合成3。在其他生物中，该活性由额外的酶补充4，但这种替代途径在人类中是否存在仍未知。在这里，我们在人类单倍体细胞中破坏DGAT途径，并使用迭代遗传学揭示一个无关的TAG合成系统，由我们称为DIESL（也称为TMEM68，一种功能未知的酰基转移酶）的蛋白及其调节因子TMX1组成。机制上，TMX1在内质网结合并控制DIESL，TMX1的缺失导致DIESL依赖性脂滴不受约束地形成。DIESL是一种自主的TAG合酶，人类DIESL在大肠杆菌中的表达赋予该生物体合成TAG的能力。尽管DIESL和DGAT都作为二酰甘油酰基转移酶，但它们在特定条件下对细胞TAG库有贡献。功能上，DIESL以膜磷脂为代价合成TAG，并在细胞外脂质饥饿期间维持线粒体功能。在小鼠中，DIESL缺乏阻碍快速出生后生长，并在营养可利用性变化期间影响能量稳态。因此，我们鉴定了一种由DIESL驱动、受TMX1强控制的替代TAG生物合成途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在DGAT途径缺失的情况下，人类细胞是否存在替代的甘油三酯合成途径，其组成和调控机制是什么？
- 核心机制
- TMX1在内质网结合并抑制DIESL，当TMX1缺失时，DIESL作为二酰甘油酰基转移酶，以膜磷脂为代价合成TAG，支持线粒体功能和能量稳态。
- 主要证据
- 单倍体遗传筛选鉴定TMX1和DIESL；DIESL表达赋予大肠杆菌TAG合成能力；无细胞实验证明DIESL催化DAG转化为TAG；DIESL基因敲除小鼠表现出生长迟缓和能量代谢改变。
- 研究意义
- 该研究揭示了一种在营养匮乏时重要的非经典TAG合成途径，可能与癌症和神经退行性疾病等能量敏感病理相关。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
正向遗传筛选鉴定TMX1
在DGAT DKO细胞中寻找DGAT非依赖性TAG积累的抑制因子。
在DGAT DKO HAP1细胞中进行基因陷阱诱变，结合BODIPY 493/503染色和FACS分选高/低脂滴群体，深度测序鉴定突变基因。
TMX1功能验证和特异性分析
确认TMX1对TAG积累的抑制作用及其特异性。
在多种细胞系（HAP1、293T、A549、U2OS）中敲除TMX1，通过TLC、脂滴染色和免疫印迹验证TAG积累；回补TMX家族成员，确认只有TMX1具有抑制作用。
抑制子筛选鉴定DIESL
寻找TMX1缺失条件下TAG积累所必需的基因。
在ΔTMX1 HAP1细胞中进行基因陷阱诱变，以脂滴积累为读出的抑制子筛选，并与WT细胞油酸加载的筛选比较，鉴定DIESL为特异性驱动因子。
TMX1与DIESL的物理相互作用验证
验证TMX1和DIESL是否形成复合物。
通过甲醛交联和免疫共沉淀实验，在HAP1和HeLa细胞中检测TMX1与DIESL的相互作用；利用去垢剂依赖性和亚细胞分离进一步证实。
DIESL酶活性表征
证明DIESL是一种二酰甘油酰基转移酶，并确定其活性位点。
通过同源建模和序列比对预测DIESL的催化二联体（H130和D136）；构建H130A突变体，在HAP1细胞中检测其对TAG积累的影响；在大肠杆菌中异源表达，检测TAG合成能力。
脂质组学分析
全面分析DIESL活性对细胞脂质组的影响。
在4KO（ΔDGAT1ΔDGAT2ΔDIESLΔTMX1）HAP1细胞中回补野生型或H130A DIESL，通过鸟枪法脂质组学分析各脂质类别变化。
细胞功能研究
评估DIESL在脂质饥饿时对线粒体功能和细胞活力的影响。
在多种DIESL缺陷细胞系（RPE1、U251、HT29、293T）中，检测脂蛋白缺乏条件下的AMPK磷酸化、线粒体ROS、膜电位、ATP水平及细胞活力，并通过油酸和依托莫西（CPT1A抑制剂）进行干预。
小鼠体内功能验证
评估DIESL在体内的生理作用。
利用基因陷阱构建DIESL基因敲除小鼠，监测体重、生长曲线、身体组成、肝脂质含量、呼吸交换比等指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | IMDM培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| DMEM培养基 | 文中未明确说明 | -- | |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 脂滴染色 | BODIPY 493/503 | ThermoFisher | -- |
| BODIPY 665/676 | ThermoFisher | -- | |
| 线粒体功能检测 | TMRM | ThermoFisher | -- |
| MitoTracker Red CM-H2XROS | ThermoFisher | -- | |
| 药物处理 | 布雷菲德菌素A | Sigma-Aldrich | -- |
| 依托莫西 | Sigma-Aldrich | -- | |
| PF-06424439（DGAT2抑制剂） | Sigma-Aldrich | -- | |
| A-922500（DGAT1抑制剂） | Selleck | -- | |
| 脂质标准品 | 三油酸甘油酯 | Avanti Polar Lipids | -- |
| 二油酸甘油酯 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 放射标记底物 | 14C标记二酰甘油 | American Radiolabeled Chemicals | -- |
| 荧光底物 | NBD标记二酰甘油 | Avanti Polar Lipids | -- |
| 免疫印迹 | 抗ACTB抗体 | Abcam | ab6276 |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32293 | |
| 抗AMPK抗体 | Cell Signaling Technology | 2532 | |
| 抗磷酸化AMPK抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 | |
| 免疫荧光/免疫印迹 | 抗CANX抗体 | Abcam | ab22595 |
| 免疫印迹 | 抗CLTC抗体 | Thermo Fisher | PA5-17347 |
| 抗EIF4G抗体 | Cell Signaling Technology | 2498 | |
| 抗FASN抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-55580 | |
| 免疫荧光/免疫印迹 | 抗HA抗体 | Biolegend | 901503 |
| 免疫印迹 | 抗HSPA5抗体 | Cell Signaling Technology | 3177 |
| 抗LAMP1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-19992 | |
| 抗LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | 2775 | |
| 抗LDHA抗体 | Cell Signaling Technology | 3582 | |
| 免疫荧光/免疫印迹 | 抗PDI抗体 | Abcam | ab2792 |
| 免疫印迹 | 抗S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2137 |
| 抗磷酸化S6抗体 | Cell Signaling Technology | 4856 | |
| 免疫荧光/免疫印迹 | 抗TMX1抗体 | Atlas Antibodies | HPA003085 |
| 免疫印迹 | 抗TMX1抗体 | Origene | TA507042 |
| 抗TOMM20抗体 | Abcam | ab186735 | |
| 免疫荧光/免疫印迹 | 抗V5抗体 | ThermoFisher | 14-6796-82 |
| 基因编辑 | pX330载体 | 文中未明确说明 | -- |
| pLentiCRISPRv2载体 | 文中未明确说明 | -- | |
| BbsI限制酶 | New England BioLabs | -- | |
| BsmBI限制酶 | New England BioLabs | -- | |
| 蛋白表达 | pLEX305载体 | 文中未明确说明 | -- |
| pET24载体 | Twist Bioscience | -- | |
| pET28a载体 | 文中未明确说明 | -- | |
| 转染 | Xfect转染试剂 | Takara | -- |
| 蛋白纯化 | 抗HA磁珠 | Pierce | -- |
| 去糖基化 | PNGase F酶 | New England BioLabs | -- |
| 测序 | S3分选仪 | Bio-Rad | -- |
| 蛋白电泳 | Bolt 4-12% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | -- |
| 免疫印迹 | Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- |
| Universal Hood II GelDoc系统 | Bio-Rad | -- | |
| EZ Imager GelDoc系统 | Bio-Rad | -- | |
| 磷屏成像 | Typhoon FLA 9500磷屏成像仪 | General Electric | v.1.1.0.187 |
| BAS-TR2949成像板 | Fuji | -- | |
| 电镜 | Tecnai 12 G2透射电镜 | ThermoFisher | -- |
| 显微镜 | Leica SP5共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 流式细胞术 | LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 小鼠饲料 | RM3-SAFE饲料 | Special Diet Services | -- |
| V1554-703饲料 | Ssniff Spezialdiäten | -- | |
| 代谢监测 | LabMaster代谢监测系统 | TSE systems | -- |
| 身体组成分析 | MiniSpec LF90 BCA分析仪 | Bruker | -- |
| 组织学 | Zeiss Axioskop2 Plus显微镜 | Carl Zeiss Microscopy | -- |
| Zeiss AxioCam HRc相机 | Carl Zeiss Vision | -- | |
| 软件 | FlowJo软件 | BD Life Sciences | -- |
| ImageJ软件 | NIH | -- | |
| Prism软件 | GraphPad Software | -- | |
| RStudio软件 | RStudio | -- | |
| 测序分析 | LipidXplorer软件 | Lipotype | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 遗传筛选 | 基因陷阱突变效率、HAP1细胞倍性、BODIPY染色浓度和孵育时间、FACS分选门控 阅读提示：Methods: Mutagenesis screening |
| TAG检测 | 细胞数量、脂质提取方法、TLC展开剂配比、染色剂浓度和时间 阅读提示：Methods: TLC and DAG acylation assays |
| DIESL酶活性 | DIESL表达载体、H130A突变、大肠杆菌菌株和诱导条件（IPTG浓度、温度、时间） 阅读提示：Methods: Recombinant expression in E.coli; Extended Data Fig. 4 |
| 脂质组学 | 细胞培养条件、样本制备、脂质提取流程、质谱参数 阅读提示：Methods: Shotgun lipidomics |
| 体内实验 | 小鼠品系（C57BL/6J或N），基因型鉴定，饮食条件（RM3-SAFE或V1554-703），Nnt基因型，实验环境（温度、湿度、光照周期） 阅读提示：Methods: Mice; Generation and genotyping |