STING激活与转运
观察激活后pSTING的亚细胞定位变化。
用diABZI刺激HeLaSTING细胞，固定染色观察pSTING与TGN46、LAMP1共定位。
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网格蛋白相关AP-1控制STING信号终止
Clathrin-associated AP-1 controls termination of STING signalling
实验完整度
高该研究包含多个独立证据层级：细胞实验（HeLa、MEF等）、体外生化重构（pull-down、BLI）、冷冻电镜结构，并包含功能验证（免疫应答、病毒复制）和机制验证（突变、磷酸化）。
主要模型
HeLa细胞 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） SAVI患者成纤维细胞
重点核对
AP-1亚基（AP1G1、AP1S1、AP1B1）的敲低 STING双亮氨酸基序（EXXXLI）突变 TBK1依赖性磷酸化（S366） AP-1σ亚基突变（K60A/R61A等） STING激动剂diABZI浓度及处理时间
摘要
干扰素基因刺激因子（STING）在DNA感知中位于环状GMP-AMP合酶下游，或作为细菌环状二核苷酸和小分子的直接受体，在感染、癌症和免疫治疗过程中激活免疫。STING的精确调控对于确保免疫应答平衡和防止有害的自身炎症至关重要。激活后，STING（一种跨膜蛋白）从内质网转运至高尔基体，在那里被蛋白激酶TBK1磷酸化以实现信号转导。终止STING在高尔基体信号传导的机制仍然未知。在这里，我们显示衔接蛋白复合物1（AP-1）控制STING依赖性免疫激活的终止。我们发现AP-1将磷酸化的STING分选入网格蛋白包被的转运囊泡，递送至内溶酶体系统，在那里STING被降解。我们在STING胞质C末端尾（CTT）中鉴定出一个高度保守的双亮氨酸基序，该基序与TBK1依赖性CTT磷酸化一起，决定了AP-1与STING的结合。AP-1与磷酸化STING复合物的冷冻电镜结构解释了TBK1激活的STING增强识别的机制。我们显示抑制AP-1会加剧STING诱导的免疫应答。我们的结果揭示了STING负调控的结构机制，并确定信号传导的启动与其终止密不可分，以实现免疫的短暂激活。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AP-1如何终止STING依赖性免疫信号？
- 核心机制
- AP-1识别磷酸化STING的EXXXLI基序，将pSTING分选入网格蛋白包被囊泡，运至内溶酶体降解，从而终止信号。
- 主要证据
- AP-1与pSTING共定位及结合（免疫共沉淀、pull-down），AP-1敲低导致pSTING积累及IFN应答增强，冷冻电镜结构显示pSTING的pS366与AP-1σ亚基结合。
- 研究意义
- 揭示了STING信号终止的结构机制，为调节STING免疫效应提供概念性策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CCV中pSTING的检测
验证pSTING是否进入网格蛋白包被囊泡。
提取CCV组分，Western blot检测STING和pSTING；共聚焦、STED、CLEM观察。
AP-1功能验证
确定AP-1是否参与STING降解和信号终止。
siRNA敲低AP-1亚基，检测STING/pSTING水平及IFN应答；AP-1σ1敲除和μ1敲除MEF验证。
AP-1与STING结合验证
验证AP-1与pSTING的直接相互作用。
免疫共沉淀检测STING与AP-1γ/σ1结合；体外GST pull-down和BLI分析。
突变分析确定关键基序
鉴定STING与AP-1结合所需的关键氨基酸。
构建STING突变体（E360A、L364A、I365A等），检测其与AP-1的结合及信号活性。
TBK1磷酸化调控
验证TBK1磷酸化是否增强STING与AP-1的结合。
敲低或抑制TBK1，检测STING-AP-1结合和STING降解；体外磷酸化后进行BLI。
冷冻电镜结构解析
解析AP-1与pSTING复合物的结构，阐明识别机制。
制备AP-1-ARF1-pSTING复合物，进行冷冻电镜数据采集和重构。
AP-1缺失对免疫应答的影响
评估AP-1缺失对STING介导免疫应答的后果。
检测AP-1敲低细胞的I型干扰素应答及HSV-1复制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证蛋白互作
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 41965039 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| 青霉素-链霉素 | BioConcept | 4-01F00-H | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21875091 | |
| 人上皮细胞培养基 | Cell Biologics | H6621 | |
| 质粒构建 | pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0质粒 | Addgene | 62988 |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)质粒 | Addgene | 48138 | |
| pCDNA3-HA γ-adaptin 1质粒 | Addgene | 10712 | |
| NF-κB荧光素酶报告质粒 | Promega | E8491 | |
| 转染 | 脂质体2000 | Invitrogen | 11668019 |
| OptiMEM培养基 | Life Technologies | 31985047 | |
| GeneJuice转染试剂 | Millipore | 70967 | |
| 脂质体RNAiMAX | Invitrogen | 13778075 | |
| siRNA转染 | Silencer select siRNA | Thermo Fisher Scientific | 4390847 |
| siAP1G1 | Thermo Fisher Scientific | s1143 | |
| siAP1B1 | Thermo Fisher Scientific | s1141 | |
| siAP1S1 | Thermo Fisher Scientific | s3115 | |
| siAP1S3 | Thermo Fisher Scientific | s43490 | |
| siIRF3 | Mircosynth | -- | |
| siTBK1 | Mircosynth | -- | |
| 药物处理 | diABZI | Selleckchem | S8796 |
| cGAMP | Invivogen | -- | |
| 90mer dsDNA | -- | -- | |
| IVT4 RNA | -- | -- | |
| 聚肌胞苷酸 | Invivogen | -- | |
| BX795 | MedChemExpress | -- | |
| 巴弗洛霉素A1 | Sigma | -- | |
| DMXAA | Invivogen | -- | |
| H-151 | -- | -- | |
| 抗体 | 抗Vinculin抗体 | Sigma-Aldrich | V9264 |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗磷酸化STING (Ser366)抗体 | Cell Signaling Technology | 19781 | |
| 抗磷酸化TBK1/NAK (Ser172)抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| 抗磷酸化IRF3 (Ser386)抗体 | Abcam | ab76493 | |
| 抗TBK1/NAK抗体 | Cell Signaling Technology | 3504 | |
| 抗TMEM173/STING抗体 | Proteintech | 19851-1-AP | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 11904 | |
| 抗网格蛋白重链抗体 | Cell Signaling Technology | 2410 | |
| 抗网格蛋白重链抗体(X22) | Thermo Fisher Scientific | MA1-065 | |
| 抗AP1S1抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-63913 | |
| 抗AP1G1抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-65290 | |
| 抗AP1B1抗体 | Sigma-Aldrich | HPA065226 | |
| 抗AP1M1抗体 | Proteintech | 12112-1-AP | |
| 抗HSV-1 ICP0抗体 | Santa Cruz | sc-53090 | |
| 抗HA.11抗体 | Biolegend | MMS-101R | |
| 抗γ-adaptin抗体 | Sigma-Aldrich | A4200 | |
| 抗EEA1抗体 | Cell Signaling | 48453 | |
| 抗LAMP1抗体 | Abcam | ab25630 | |
| 抗磷酸化STING (Ser366) (D8K6H)抗体 | Cell Signaling Technology | 40818 | |
| 抗RAB7抗体 | Cell Signaling Technology | 95746 | |
| 抗TGN46抗体 | Bio-Rad | AHP500G | |
| 驴抗兔IgG (H+L)-HRP二抗 | Jackson ImmunoResearch | 711-036-152 | |
| 驴抗小鼠IgG (H+L)-HRP二抗 | Jackson ImmunoResearch | 715-036-151 | |
| 山羊抗小鼠IgG2a，Alexa Fluor 647二抗 | Invitrogen | A-21241 | |
| 驴抗绵羊IgG (H+L)，Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | A-11015 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L)，Alexa Fluor 568二抗 | Invitrogen | A-11011 | |
| 山羊抗兔IgG F(ab) ATTO647N二抗 | Hypermol | 2318 | |
| RT-qPCR | RNeasy Plant Mini Kit试剂盒 | Qiagen | -- |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| QuantStudio 7实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | SurePAGE预制胶 | GenScript | -- |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi硝酸纤维素转印试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| cOmplete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| Western blot检测试剂 | Advansta | -- | |
| ChemiDoc XRS Bio-Rad成像仪 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗Flag M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| 荧光素酶实验 | 腔肠素 | PJK GmbH | -- |
| Bright-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| 细胞活力 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测系统 | Promega | -- |
| CCV提取 | 核糖核酸酶A | -- | -- |
| Type 70 Ti转子 | Beckman Coulter | -- | |
| 显微镜 | CellCarrier-96 Ultra微孔板 | PerkinElmer | 6055302 |
| µ-Slide八孔腔室玻片 | ibidi | 80826-IBI | |
| Hoechst 33342染料 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Leica SP8倒置显微镜 | Leica | -- | |
| PerkinElmer Operetta CLS显微镜 | PerkinElmer | -- | |
| Zeiss LSM 980显微镜 | Zeiss | -- | |
| CLEM | 玻璃底培养皿 | MatTek | P35G-1.5-14-CGRD |
| Durcupan ACM树脂 | Fluka | -- | |
| 钻石刀 | Diatome | -- | |
| 超薄切片机UC7 | Leica Microsystems | -- | |
| Tecnai Spirit透射电子显微镜 | FEI Company | -- | |
| Eagle相机 | FEI Company | -- | |
| STED | FluoroDish培养皿 | WFD35-100 | -- |
| Leica SP8 STED 3X显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| 蛋白表达纯化 | HisTrap HP柱 | Cytiva | 17524802 |
| Superdex 75 Hiload 16/600柱 | Cytiva | 28-9893-33 | |
| Ni-NTA柱 | -- | -- | |
| 谷胱甘肽琼脂糖4B柱 | Cytiva | 28401748 | |
| Superose 6 HiLoad 16/600柱 | Cytiva | 29323952 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL柱 | Cytiva | 28990944 | |
| IPTG | -- | -- | |
| 体外磷酸化 | TBK1激酶 | MRC PPU Reagents | DU12469 |
| BLI | GatorPrime生物传感器系统 | GatorBio | -- |
| 链霉亲和素探针 | GatorBio | 160002 | |
| EZ-Link-NHS-LC-LC-生物素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PD 10脱盐柱 | Cytiva | -- | |
| 冷冻电镜 | Quantifoil网格 | Electron Microscopy Sciences | Q250AR1.3 |
| TFS Glacios显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TFS Titan Krios G4显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Falcon IV探测器 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系和来源；培养基及添加物；培养条件 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 药物刺激 | 激动剂种类、浓度、处理时间 阅读提示：Methods: Stimulation of cells |
| siRNA敲低 | siRNA靶点、浓度、转染试剂及时间 阅读提示：Methods: Transfection |
| 免疫共沉淀 | 抗体、裂解缓冲液、洗涤次数 阅读提示：Methods: Western blotting and immunoprecipitation |
| Western blot | 抗体、稀释比例、上样量 阅读提示：Methods: Western blotting and immunoprecipitation |
| RT-qPCR | 引物序列、内参基因、分析方法 阅读提示：Methods: RT–qPCR |
| CCV提取 | 提取方法、离心条件 阅读提示：Methods: CCV extraction |
| 显微成像 | 显微镜型号、染色方法、图像分析软件 阅读提示：Methods: Sample preparation for confocal microscopy, Airyscan microscopy, CLEM, STED |
| 体外结合实验 | 蛋白浓度、缓冲液、孵育时间 阅读提示：Methods: GST pull-down assay, Bio-layer interferometry |
| 冷冻电镜 | 样品制备、数据采集参数、数据处理流程 阅读提示：Methods: Cryo-EM data acquisition, Cryo-EM data processing |