体外验证Sestrin与亮氨酸及GATOR2的结合
验证果蝇Sestrin是否直接结合亮氨酸，以及该结合是否受亮氨酸调控并影响与GATOR2的相互作用。
通过平衡结合实验测定果蝇Sestrin与亮氨酸的解离常数；在S2R+细胞中表达FLAG标记的GATOR2组分，进行免疫共沉淀，检测Sestrin-GATOR2复合物对亮氨酸剥夺和加入的响应。
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Sestrin介导果蝇对低亮氨酸饮食的检测与适应
Sestrin mediates detection of and adaptation to low-leucine diets in Drosophila
实验完整度
高包含体外结合实验、细胞实验、体内遗传操作（敲除、敲入、组织特异性敲低）、发育和寿命分析、行为学实验（食物选择和产卵偏好）以及胶质细胞mTORC1活性成像等多个独立证据层，且包含明确的功能验证和机制验证。
主要模型
果蝇（Drosophila melanogaster）成虫和幼虫 S2R+细胞 HEK293F细胞
重点核对
Sestrin的亮氨酸结合能力（通过SesnL431E突变） 饮食中亮氨酸的有无 胶质细胞中Sestrin的表达 mTORC1活性（以磷酸化S6K水平为指标） 观察时间点（如24小时行为测试，4.5小时饮食处理）
摘要
雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）响应多种营养物质（包括必需氨基酸亮氨酸）调节细胞生长和代谢。近期在培养的哺乳动物细胞中的研究确立了Sestrin作为亮氨酸结合蛋白，在亮氨酸缺乏时抑制mTORC1信号传导，但其在机体对膳食亮氨酸反应中的作用仍然难以捉摸。在此，我们发现Sestrin缺失果蝇（Sesn−/−）在急性亮氨酸饥饿后无法抑制mTORC1或激活自噬，并且在低亮氨酸饮食上发育受损且寿命缩短。表达亮氨酸结合缺陷型Sestrin突变体（SesnL431E）的敲入果蝇具有降低的、对亮氨酸不敏感的mTORC1活性。值得注意的是，我们发现果蝇能够区分含或不含亮氨酸的食物，并优先在含亮氨酸的食物上取食和产卵。这种偏好依赖于Sestrin及其结合亮氨酸的能力。亮氨酸调节胶质细胞中的mTORC1活性，并且这些细胞中Sesn的敲低降低了果蝇检测无亮氨酸食物的能力。因此，mTORC1的营养感知不仅对果蝇适应缺乏必需营养素的饮食是必要的，而且对其检测这种饮食也是必要的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Sestrin及其亮氨酸结合能力是否在体内介导果蝇对膳食亮氨酸的感知和适应。
- 核心机制
- Sestrin通过其亮氨酸结合口袋感知亮氨酸，调控mTORC1信号通路，进而影响生理和行为反应。
- 主要证据
- Sesn−/−果蝇在亮氨酸饥饿时无法抑制mTORC1，寿命缩短；SesnL431E突变体mTORC1活性降低且不响应亮氨酸；胶质细胞中Sestrin敲低降低了果蝇对含亮氨酸食物的偏好，且mTORC1报告基因显示亮氨酸缺乏特异性激活食道周围胶质细胞中的MITF活性。
- 研究意义
- 该研究首次在体内证明了Sestrin作为生理相关的亮氨酸传感器，并揭示了mTORC1营养感知在果蝇适应和检测必需营养素缺乏饮食中的必要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内验证Sestrin介导亮氨酸对mTORC1的调控
在果蝇幼虫脂肪体中验证Sestrin及其亮氨酸结合能力对膳食亮氨酸调控mTORC1信号的必要性。
使用野生型、Sesn−/−和SesnL431E幼虫，喂食氨基酸充足或缺乏亮氨酸（或缬氨酸）的化学定义饮食，通过免疫印迹检测S6K磷酸化水平，并检查Sestrin-GATOR2相互作用。
评估Sestrin对低亮氨酸饮食适应的影响
确定Sestrin是否影响果蝇在低亮氨酸饮食上的发育和寿命。
比较野生型、Sesn−/−和SesnL431E幼虫在10%亮氨酸饮食上的存活率和生长大小；成年果蝇在无亮氨酸或对照组饮食上的寿命。
分析Sestrin对食物选择行为的影响
检验果蝇是否偏好含亮氨酸的食物，以及该偏好是否依赖于Sestrin及其亮氨酸结合能力。
使用双选择食物偏好实验，将含亮氨酸或对照的溶液涂在苹果片上，通过DNA条形码定量取食量，比较不同基因型果蝇的偏好指数。
鉴定Sestrin调控食物偏好的组织
确定Sestrin在哪个组织中起作用以调节食物偏好。
使用组织特异性Gal4驱动RNAi敲低Sesn，检测果蝇对含亮氨酸食物的偏好，并检查胶质细胞中mTORC1活性（通过MITF报告基因）。
分析Sestrin对产卵行为的影响
探究Sestrin是否影响果蝇选择在含亮氨酸食物上产卵。
在类似的食物偏好装置中，24小时后计数苹果片上的卵数，比较不同基因型果蝇的产卵偏好。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | HRP标记的抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | -- |
| 抗磷酸化70 S6激酶（Thr398）抗体 | Cell Signaling Technology | 9209 | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗MYC抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG抗体 | Cell Signaling Technology | 2368 |
| 免疫荧光 | 抗绿色荧光蛋白抗体 | Aves Labs | GFP-1020 |
| 抗Repo抗体（8D12） | Developmental Studies Hybridoma Bank | -- | |
| Alexa 488、568和647标记的二抗 | Roche | -- | |
| 细胞培养 | Schneider培养基 | Invitrogen | -- |
| 灭活胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 无氨基酸Schneider培养基 | US Biologicals | -- | |
| 亮氨酸结合实验 | 氚标记亮氨酸 | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | -- |
| 饮食制备 | L-亮氨酸 | Sigma | L8912 |
| 药物处理 | 雷帕霉素 | LC Laboratories | R-5000 |
| RT-qPCR | Reliance一步法多重RT-qPCR预混液 | BIO-RAD | -- |
| 食物偏好实验 | 新鲜苹果（嘎啦） | Star Market | -- |
| 细胞培养 | FreeStyle 293表达培养基 | ThermoFisher | 12338018 |
| 分子克隆 | LR克隆酶反应 | Invitrogen | 11791-020 |
| 荧光显微镜 | Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | -- |
| DAPI | Vector Laboratories | -- | |
| 蛋白提取 | 完全蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma | A2220 |
| 抗Myc磁珠 | Pierce | -- | |
| 组织裂解 | 蛋白酶K | Thermofisher Scientific | AM2546 |
| qPCR | SYBR green qPCR预混液 | BIO-RAD | -- |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统 | BIO-RAD | -- | |
| 食物偏好实验 | DNA寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | -- |
| Contrex AP粉末实验室器皿清洁剂 | Decon Laboratories, Inc. | 5204 | |
| 饮食制备 | 蔗糖 | Sigma | S7903 |
| 琼脂 | Caisson | A037 | |
| L-丙氨酸 | Sigma | A7469 | |
| L-天冬酰胺 | Amresco | 94341 | |
| L-天冬氨酸 | Alfa Aesar | A13520 | |
| L-谷氨酰胺 | Amresco | 0374 | |
| L-组氨酸 | Amresco | 1B1164 | |
| L-异亮氨酸 | Amresco | E803 | |
| L-甲硫氨酸 | Amresco | E801 | |
| L-苯丙氨酸 | Sigma | P5482 | |
| L-苏氨酸 | Sigma | T8441 | |
| L-色氨酸 | Amresco | E800 | |
| L-缬氨酸 | Amresco | 1B1102 | |
| L-精氨酸盐酸盐 | Amresco | 0877 | |
| L-半胱氨酸 | Sigma | 30089 | |
| L-谷氨酸 | Alfa Aesar | A12919 | |
| L-甘氨酸 | Alfa Aesar | A13816 | |
| L-赖氨酸盐酸盐 | Amresco | 0437 | |
| L-脯氨酸 | Sigma | P5607 | |
| L-丝氨酸 | Sigma | S4311 | |
| L-酪氨酸 | Sigma | T8566 | |
| 生物素 | Sigma | B4501 | |
| 泛酸钙 | Sigma | 21210 | |
| 烟酸 | Sigma | N4126 | |
| 盐酸吡哆醇 | Sigma | P9755 | |
| 核黄素 | Sigma | R4500 | |
| 硫胺素（维生素B1） | Sigma | T4625 | |
| 叶酸 | Sigma | F8758 | |
| 氯化胆碱 | MP Biomedicals | 194639 | |
| 肌苷 | Sigma | I4125 | |
| 肌醇 | Sigma | I7508 | |
| 尿苷 | Sigma | U3003 | |
| 磷酸二氢钾 | JT Baker | 3246 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S8875 | |
| 六水氯化钙 | Sigma | 21108 | |
| 五水硫酸铜 | Sigma | C7631 | |
| 七水硫酸亚铁 | Sigma | F7002 | |
| 无水硫酸镁 | Sigma | M7506 | |
| 四水氯化锰 | Sigma | M3634 | |
| 七水硫酸锌 | Sigma | Z0251 | |
| 胆固醇 | Sigma | C8253 | |
| 细胞培养转染 | 聚乙烯亚胺 | 文中未明确说明 | -- |
| 闪烁计数 | TriCarb闪烁计数器 | Perkin Elmer | -- |
| 显微镜 | 蔡司Axio Zoom V16 | Zeiss | -- |
| 蔡司AxioVert200M显微镜 | Zeiss | -- | |
| 横河CSU-22转盘共聚焦头 | Yokogawa | -- | |
| 滨松ORCA-ER CCD相机 | Hamamatsu | -- | |
| MetaMorph软件包 | Molecular Devices | -- | |
| 图像采集 | iPhone XR相机 | Apple | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Sestrin亮氨酸结合实验 | 果蝇Sestrin蛋白的亮氨酸结合亲和力（Kd约100 μM）；Sestrin L431E突变体的结合活性 阅读提示：Methods中的'Leucine-binding assay and Kd calculation'，以及Fig. 1a, b |
| 体内mTORC1活性检测 | 幼虫脂肪体中S6K磷酸化水平；饮食中亮氨酸的有无；处理时间（4.5小时） 阅读提示：Methods中的'Lysis of cells, tissues, and flies and Immunoprecipitations'和Fig. 1e |
| 低亮氨酸饮食适应实验 | 幼虫存活率（10%亮氨酸饮食，16天）；成体寿命（无亮氨酸饮食）；基因型（Sesn−/−, SesnL431E） 阅读提示：Fig. 2a, b, d-i和Methods中的'Lifespan experiments' |
| 食物偏好实验 | 苹果片制备；氨基酸溶液浓度；取食时间（24小时）；DNA条形码定量方法 阅读提示：Methods中的'Food preference assay'和Fig. 3a |
| 胶质细胞Sestrin功能验证 | 组织特异性Gal4驱动子（repo-Gal4）和Sesn shRNA的基因型；食物偏好测试结果；mTORC1活性（通过MITF报告基因） 阅读提示：Fig. 4和Methods中的相关部分 |