临床样本中星形胶质细胞ANXA1表达分析
探究星形胶质细胞ANXA1表达与GBM复发及预后的关系
利用临床GBM scRNA-seq数据鉴定非恶性星形胶质细胞，分析ANXA1表达；通过多重免疫荧光和空间转录组学验证ANXA1在浸润肿瘤区域的星形胶质细胞中富集。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
条形码病毒示踪识别免疫抑制性星形胶质细胞-胶质瘤相互作用
Barcoded viral tracing identifies immunosuppressive astrocyte-glioma interactions
实验完整度
高包含至少两个独立证据层级：临床样本scRNA-seq与多重免疫荧光、多模型功能验证（细胞系、类器官、动物模型），并明确包含功能验证与机制验证（CRISPR-Cas9、RNA-seq、免疫荧光等）。
主要模型
人GBM组织样本及器官型培养 GL261原位小鼠胶质瘤模型 CT-2A原位小鼠胶质瘤模型 原代人GBM细胞系（BT485、BT482、BT1018）
重点核对
FPR1在肿瘤细胞中的表达与患者生存期及复发时间的相关性 Fpr1或Anxa1失活后肿瘤体积、生存期及免疫细胞浸润变化 ANXA1-FPR1信号对肿瘤细胞坏死性凋亡及星形胶质细胞炎症反应的影响 体内免疫细胞（CD8+ T、CD4+ T、TAM、DC）的转录组变化 GL261-RIPK3act模型中B/B homodimerizer诱导坏死性凋亡对生存及免疫的影响
摘要
胶质母细胞瘤（GBM）是最致命的原发性脑恶性肿瘤。GBM肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制是免疫靶向治疗的重要障碍，但我们对GBM TME中免疫调节机制的理解有限。在这里，我们描述了一种病毒条形码相互作用示踪方法，以单细胞分辨率分析GBM临床样本和临床前模型中的TME细胞-细胞通讯。我们将其与单细胞和批量RNA测序分析、人器官型GBM培养、体内细胞特异性CRISPR–Cas9驱动的遗传扰动以及人和小鼠实验系统相结合，以识别膜联蛋白A1–甲酰肽受体1（ANXA1–FPR1）双向星形胶质细胞–GBM通讯通路，该通路限制肿瘤特异性免疫。FPR1抑制肿瘤细胞中的免疫原性坏死性凋亡，ANXA1抑制星形胶质细胞中的NF-κB和炎症小体激活。星形胶质细胞中ANXA1的表达和癌细胞中FPR1的表达与GBM患者的不良预后相关。星形胶质细胞-胶质瘤ANXA1–FPR1信号传导的失活增强了树突状细胞、T细胞和巨噬细胞反应，增加了肿瘤特异性CD8+ T细胞的浸润并限制了T细胞耗竭。总之，我们开发了一种在临床样本和临床前模型中以单细胞分辨率分析TME细胞-细胞相互作用的方法，并用它来确定通过ANXA1–FPR1的双向星形胶质细胞–GBM通讯是免疫逃逸和肿瘤进展的驱动因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胶质母细胞瘤肿瘤微环境中星形胶质细胞与胶质瘤细胞之间的细胞间通讯如何促进免疫抑制和肿瘤进展？
- 核心机制
- 星形胶质细胞分泌的ANXA1与胶质瘤细胞表面的FPR1结合，双向信号传导：FPR1抑制肿瘤细胞的免疫原性坏死性凋亡，ANXA1抑制星形胶质细胞的NF-κB和炎症小体激活，从而限制肿瘤特异性免疫。
- 主要证据
- 临床样本scRNA-seq和多重免疫荧光显示ANXA1+星形胶质细胞与胶质瘤细胞相互作用；ptRABID-seq和taRABID-seq证实这种相互作用；Fpr1或Anxa1失活延长荷瘤小鼠生存，增加肿瘤浸润CD8+ T细胞、减少耗竭，并增强DC和巨噬细胞反应。
- 研究意义
- 揭示星形胶质细胞-胶质瘤ANXA1–FPR1通路是GBM免疫逃逸的驱动因素，为GBM免疫治疗（如疫苗、CAR T细胞、免疫检查点阻断）提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
开发ptRABID-seq并检测TME细胞互作
在临床样本中无偏识别星形胶质细胞与其他细胞类型的相互作用
建立人GBM器官型培养，用慢病毒转导TVA和G，然后感染条形码RabΔG，通过scRNA-seq检测共享条形码。
开发taRABID-seq并检测体内星形胶质细胞-胶质瘤互作
在体内肿瘤微环境中识别星形胶质细胞与胶质瘤细胞的双向相互作用及其下游信号
将表达TVA和G的GL261细胞植入小鼠颅内，建立肿瘤后注射条形码RabΔG，通过scRNA-seq分析共享条形码细胞。
验证FPR1在GBM细胞中的作用及预后关联
验证FPR1表达与GBM患者预后相关并确定其在肿瘤中的功能
通过免疫荧光验证FPR1蛋白表达并统计与生存关系；分析FPR1表达与复发时间及TCGA/GLASS队列生存的关联；在GL261细胞中CRISPR-Cas9敲除Fpr1，观察对生存及免疫的影响。
研究FPR1对胶质瘤细胞坏死性凋亡的调控
确定FPR1是否抑制肿瘤细胞坏死性凋亡及其对免疫的影响
对Fpr1敲除的GL261细胞进行RNA-seq分析坏死性凋亡通路；在体外用ANXA1和FPR1阻断抗体处理人GBM分离株检测pMLKL；构建GL261-RIPK3act模型，用B/B homodimerizer诱导坏死性凋亡，评估存活和免疫细胞变化。
研究ANXA1对星形胶质细胞炎症反应的抑制
确定星形胶质细胞分泌的ANXA1是否抑制其自身炎症反应
在体外共培养人星形胶质细胞和GBM细胞，通过LPS/poly(I:C)或TNF/IL-1β刺激，检测ASC斑点、cleaved IL-1β和NF-κB核转位；在体内通过AAV-PHP.eB在星形胶质细胞中敲除Anxa1，检测生存和炎症标志物。
评估ANXA1–FPR1信号对肿瘤免疫的影响
验证破坏该信号是否增强抗肿瘤免疫反应
通过RNA-seq和流式细胞术分析Fpr1敲除或Anxa1敲除后的T细胞和髓系细胞反应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965118 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10-438-026 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| G418遗传霉素 | Thermo Fisher Scientific | 10131027 | |
| NeuroCult NS-A人增殖试剂盒 | StemCell Technologies | 05751 | |
| B27添加剂 | Gibco | 12349015 | |
| N2添加剂 | Gibco | 17502-048 | |
| 肝素 | StemCell Technologies | 07980 | |
| 重组FGF | Invitrogen | PHG0021 | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| 人星形胶质细胞培养 | 人星形胶质细胞 | ScienCell | 1800 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 |
| 细胞培养 | Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 51985034 |
| 细胞筛选 | 博来霉素 | Invivogen | ant-zn-1 |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 杀稻瘟菌素 | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| 细胞培养 | Accutase消化液 | Stemcell Technologies | 07920 |
| 动物实验 | D-荧光素 | Cayman Chemical | 14681 |
| B/B同源二聚化诱导剂（AP20187） | Clontech Labs | 635058 | |
| RNA提取与qPCR | RNeasy试剂盒 | Qiagen | 74004 |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Life Technologies | 4368813 | |
| Taqman快速通用PCR预混液 | Life Technologies | 4367846 | |
| MicroAmp光学384孔板 | Thermo Fisher Scientific | 43-098-49 | |
| ViiA 7实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosciences | -- | |
| Taqman探针（Gapdh，Fpr1） | -- | Mm99999915_g1, Mm00442803_s1 | |
| 免疫荧光 | ASC抗体 | Adipogen | AL177 |
| cleaved IL-1β抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-105048 | |
| NF-κB抗体 | Cell Signaling Technology | D14E12 | |
| pMLKL抗体（人） | Abcam | ab187091 | |
| pMLKL抗体（小鼠） | Abcam | ab196436 | |
| GFAP抗体 | Abcam | ab4674 | |
| 荧光素酶抗体 | BioRad | MCA2076 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 二抗（Alexa Fluor偶联） | Invitrogen | A31573, A21203, A78948, A21206 | |
| 免疫荧光（人GBM） | SOX2抗体 | Cell Signaling Technology | 3579 |
| GFAP抗体（Abcam 13970） | Abcam | 13970 | |
| ANXA1抗体（Abcam ab214486） | Abcam | ab214486 | |
| FPR1抗体（Abcam ab113531） | Abcam | ab113531 | |
| FPR3抗体 | BioTechne | MAB3896 | |
| FPR2抗体 | Santa Cruz | sc-57141 | |
| EGFRvIII抗体 | Biozol | 31-1305-00 | |
| OLIG2抗体 | Merck Millipore | MABN50 | |
| Iba1抗体 | Synaptic Systems | 234308 | |
| 组织处理 | Hibernate A培养基 | Gibco | A1247501 |
| Millicell transwell膜 | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Neurobasal A培养基 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| 木瓜蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P4762 | |
| 髓鞘去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | |
| 胶原酶D | Roche | 11088858001 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Thermo Fisher Scientific | 90083 | |
| Percoll分离液 | GE Healthcare Biosciences | GE17-0891-01 | |
| 免疫沉淀/体外实验 | 重组人ANXA1蛋白 | R&D Systems | 3770-AN-050 |
| 中和性FPR1抗体 | R&D Systems | MAB3744 | |
| Z-VAD(OMe)-FMK（泛caspase抑制剂） | MedChem Express | HY-16658 | |
| 重组人TNF | R&D Systems | 210-TA | |
| 体外实验 | 脂多糖 | Invivogen | tlrl-eklps |
| 聚肌胞苷酸 | Invivogen | tlrl-pic | |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA | |
| IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| 共培养实验 | FPR1抑制剂T-0080 | Sigma Aldrich | SML3283 |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD固定性Aqua死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | L34966 |
| CD16/CD32 Fc受体阻断剂 | BD Biosciences | 553142 | |
| BD FACSymphony分析仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACSAria IIU分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| Pan T细胞分离试剂盒II（小鼠） | Miltenyi Biotec | 130-095-130 | |
| CD11c磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-125-835 | |
| CD8+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-543 | |
| GARC-1四聚体 | NIH Tetramer Core | -- | |
| 胸腺嘧啶核苷 | -- | -- | |
| 蛋白浓度测定 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23235 |
| 细胞迁移实验 | NIH-3T3细胞 | ATCC | CRL-1658 |
| Transwell膜（Celltreat） | Celltreat | 230633 | |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| 影像学 | In-Vivo Xtreme光学/X射线成像系统 | Bruker | -- |
| Bruker MI SE v7软件 | Bruker | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系（C57BL/6J）、细胞系（GL261-Luc2）、植入细胞数（1×10^5）、注射体积（3μl）、立体定位坐标（+1.8mm lateral, +0.5mm anterior）、注射深度（3mm） 阅读提示：Methods: Orthotopic tumour model and intratumoral delivery |
| Fpr1基因敲除 | sgRNA序列（sgFpr1: 5'-ATTGCCAGCATGGTCATGGG-3'）、转染试剂（Lipofectamine 3000）、筛选抗生素（Zeocin 800 μg/ml） 阅读提示：Methods: Generation of GL261 cell lines |
| 坏死性凋亡诱导 | GL261-RIPK3act细胞比例（30%）、B/B homodimerizer剂量（5 mg/kg）、给药途径（retro-orbital）、给药时间（肿瘤植入后5天） 阅读提示：Methods: Orthotopic tumour model and intratumoral delivery; Figure 3p |
| 星形胶质细胞Anxa1敲除 | AAV-PHP.eB血清型、注射剂量（5×10^12 genome copies）、注射途径（retro-orbital）、注射时间（肿瘤植入前3周）、sgRNA序列（sgAnxa1: 5'-GCAAACAGCAACAATTGACA-3'） 阅读提示：Methods: Design of adeno-associated virus constructs; AAV packaging |
| 体外星形胶质细胞-胶质瘤共培养 | 人星形胶质细胞（ScienCell 1800）、人GBM细胞（BT1018, BT145, BT482）、细胞比例（1:1）、FPR1抑制剂T-0080浓度（10 μM）、刺激条件（LPS 10 ng/ml 3h + poly(I:C) 500 ng/ml 3h；TNF 10 ng/ml + IL-1β 20 ng/ml 1h） 阅读提示：Methods: Co-culture assays with human astrocytes and GBM cells |
| 体外坏死性凋亡检测 | 人GBM分离株（BT1018, BT145, BT482）、ANXA1浓度（4 μg/ml）、FPR1抗体浓度（4 μg/ml）、Z-VAD-FMK (20 μM)、cycloheximide (20 μM)、TNF (20 ng/ml)、处理时间（8h） 阅读提示：Methods: Co-culture assays with human astrocytes and GBM cells; Figure 3n |
| DC-T细胞共培养 | GL261-OVA-RIPK3act细胞、B/B homodimerizer浓度（50 μM）、处理时间（4h）、DC与T细胞比例（5000:25000）、lysate浓度（10 μg/well）、共培养时间（72h） 阅读提示：Methods: Co-culture of GL261-OVA-RIPK3act lysate-pulsed DCs and OT1 CD8+ T cells |
| 流式分析 | 抗体克隆和荧光标记、GARC-1四聚体染色浓度（1:50）、刺激条件（PMA 50 ng/ml, ionomycin 1 μM, GolgiStop/Plug 1:1500, 4h） 阅读提示：Methods: Flow cytometry; FACS analysis of T cells |