验证去N-糖基化小RNA的免疫刺激活性
探究去除N-聚糖是否能触发先天免疫反应。
从HeLa细胞分离小RNA，用PNGase F处理去除N-聚糖，转染至RAW巨噬细胞，检测IFNβ等细胞因子。
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RNA的N-糖基化实现免疫逃逸和稳态胞葬作用
RNA N-glycosylation enables immune evasion and homeostatic efferocytosis
实验完整度
高包含体外细胞实验、基因敲除、合成RNA验证、体内小鼠实验及RNA-seq分析等多层证据，并验证了机制。
主要模型
HeLa细胞 U2OS细胞（DTWD2 KO克隆） RAW 264.7巨噬细胞 小鼠腹膜巨噬细胞 THP1巨噬细胞 C57BL/6J小鼠（WT和基因敲除）
重点核对
PNGase F处理浓度和持续时间（2 μg或更高，2小时） DTWD2敲除细胞系 合成acp3U修饰的RNA序列 凋亡诱导方法（阿霉素或紫外线） TLR3和TLR7敲除小鼠模型
摘要
糖基化对于生物分子的定位和功能至关重要。我们最近发现小RNA在修饰的RNA碱基3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷(acp3U)上发生N-糖基化。然而，RNA的N-糖基化的功能意义尚不清楚。在这里，我们展示了glycoRNA上的N-聚糖可防止先天免疫系统对内源性小RNA的感知。我们发现，对细胞培养来源和循环中的人和鼠glycoRNA进行去N-糖基化，会引发强烈的炎症反应，包括以Toll样受体3和Toll样受体7依赖性方式产生I型干扰素。此外，我们表明，细胞表面RNA上的N-聚糖可防止凋亡细胞触发胞葬细胞中的内体RNA传感器，从而促进死亡细胞的无炎症清除。机制上，N-聚糖隐藏了高修饰的尿嘧啶碱基acp3U，我们鉴定出当acp3U在RNA中暴露时具有免疫刺激作用。与此一致，敲除合成acp3U的酶(DTWD2)可消除去N-糖基化的小RNA和凋亡细胞引起的先天免疫激活。此外，含有acp3U的合成RNA足以触发先天免疫反应。因此，我们的研究揭示了一种自然机制，通过该机制N-聚糖可阻止RNA诱导acp3U依赖的先天免疫激活，证明了glycoRNA如何在细胞表面和内体网络中存在的而不诱导自身炎症反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RNA的N-糖基化是否以及如何防止内源性RNA被先天免疫感知，并促进稳态胞葬作用？
- 核心机制
- N-聚糖通过化学封存免疫刺激修饰碱基acp3U，阻止其被内体RNA传感器TLR3和TLR7识别，从而避免自身RNA诱导的先天免疫激活和凋亡细胞的炎症性清除。
- 主要证据
- 使用PNGase F去除N-聚糖后，小RNA和凋亡细胞诱导IFNβ等炎症因子产生，依赖于TLR3和TLR7；DTWD2敲除或Endo-F2/F3处理（保留单个GlcNAc）消除免疫刺激；合成acp3U-RNA直接激活免疫。
- 研究意义
- 揭示了RNA糖基化在维持免疫静默和稳态胞葬中的新机制，可能为自身免疫性疾病（如SLE）的发病机制提供见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证血液循环中的glycoRNA及其免疫原性
确定人和小鼠血清中是否存在glycoRNA，并测试其去糖基化后是否具有免疫刺激性。
从血清中分离小RNA，使用rPAL标记检测glycoRNA，并用PNGase F处理，刺激小鼠腹膜巨噬细胞和THP1细胞。
评估去糖基化凋亡细胞在胞葬过程中的免疫反应
测试凋亡细胞表面RNA的N-聚糖缺失是否导致炎症反应。
用阿霉素或紫外线诱导HeLa细胞凋亡，用PNGase F处理，与巨噬细胞共培养，检测IFNβ等细胞因子。
验证DTWD2敲除对免疫刺激的影响
确定acp3U合成酶DTWD2缺失是否影响去糖基化RNA的免疫原性。
从DTWD2敲除U2OS细胞分离小RNA，或使用凋亡细胞，进行PNGase F处理，检测巨噬细胞中的IFNβ。
合成acp3U-RNA验证其免疫刺激活性
确认acp3U修饰本身足以触发免疫反应。
合成长度为18或56核苷酸的RNA，含有acp3U或未修饰U，用Lipofectamine转染或直接添加至THP1或腹膜巨噬细胞，检测细胞因子。
鉴定介导去糖基化RNA感知的受体
确定哪些模式识别受体识别去N-糖基化的RNA和凋亡细胞。
使用MyD88、TRIF、TLR3和TLR7敲除的小鼠巨噬细胞，刺激以评估IFNβ产生。
体内验证去糖基化凋亡细胞的免疫原性
在体内验证去除N-聚糖后凋亡细胞诱导的免疫反应。
将用PNGase F处理的凋亡HeLa细胞腹腔注射小鼠，24小时后测定腹膜灌洗液中的IFNβ。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | SeraPrime | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | -- | |
| TrypLE消化液 | Gibco | -- | |
| 细胞分化 | 佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Cayman Chemical | -- |
| RNA提取 | RNAzol RT试剂 | Molecular Research Center | -- |
| Zymo RNA清洁浓缩试剂盒 | Zymo Research | R1013 | |
| RNA刺激 | PNGase F Prime糖苷酶 | Bulldog Bio | -- |
| RNA酶混合物 | ThermoFisher | -- | |
| RNA酶III | New England Biolabs | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | ThermoFisher | -- |
| RNA刺激 | 聚肌胞苷酸 | InvivoGen | tlrl-pic-5 |
| 电穿孔 | Neon转染系统 | ThermoFisher | -- |
| rPAL标记 | mPEG3-Ald | BroadPharm | BP-22802 |
| 醛反应探针 | Cayman Chemicals | 10009350 | |
| Zymo-I离心柱 | Zymo Research | C1003 | |
| SYBR Gold核酸染料 | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| Intercept无蛋白封闭液 | LiCor Biosciences | 927-80001 | |
| 链霉亲和素IR800 | LiCor Biosciences | 926-32230 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | ThermoFisher | 1861279 | |
| 磷酸酶抑制剂 | ThermoFisher | 78420 | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4947 | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4302 | |
| 抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 51872 | |
| 抗磷酸化TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3873 | |
| 抗磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| 抗p38抗体 | Cell Signaling Technology | 8690 | |
| 抗磷酸化p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3031 | |
| 抗p65抗体 | Cell Signaling Technology | 6956 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| 抗JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9106 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| HRP标记抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch | 711035152 | |
| HRP标记抗鼠二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115035166 | |
| HRP标记抗羊二抗 | Jackson ImmunoResearch | 805035180 | |
| 免疫共沉淀 | 抗MyD88抗体 | R&D Systems | AF3109 |
| Protein G磁珠 | Thermo Scientific | 88847 | |
| 抗IRAK2抗体 | Cell Signaling Technology | 4367T | |
| 抗TIRAP抗体 | Cell Signaling Technology | 13077T | |
| 人原代细胞分离 | Ficoll-Paque密度梯度液 | GE Healthcare | -- |
| BDCA4偶联磁珠 | Miltenyi | -- | |
| CD14偶联磁珠 | Miltenyi | -- | |
| 人原代细胞培养 | 巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 凋亡诱导 | 阿霉素 | Cayman Chemical | 15007 |
| 紫外线 | -- | -- | |
| 胞葬抑制 | 细胞松弛素D | Enzo Life Sciences | BML-T109 |
| 拉特伦库林B | Enzo Life Sciences | BML-T110 | |
| 体内实验 | Microsep离心浓缩器 | Pall Corporation | -- |
| 流式细胞术 | CellBright Red膜染料 | Biotium | -- |
| APC偶联抗CD11b抗体 | Biolegend | 101211 | |
| FACSymphony A5流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | -- | |
| 寡核苷酸合成 | 亚磷酰胺单体 | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA SynBase CPG 1000/110固相载体 | -- | -- | |
| High Load Glen UnySupport固相载体 | Glen Research | -- | |
| Applied Biosystems 394 DNA/RNA合成仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 寡核苷酸纯化 | 高效液相色谱系统 | Agilent | -- |
| C18色谱柱 | Macherey-Nagel | -- | |
| 寡核苷酸分析 | NanoPhotometer分光光度计 | IMPLEN | -- |
| 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 | -- | -- | |
| ELISA | 抗IFNβ单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-57201 |
| 兔多克隆抗鼠IFNβ抗体 | PBL Assay Science | 32400-1 | |
| 人TNF ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7346-88 | |
| 人IL-6 ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7066-88 | |
| 鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7064-88 | |
| 鼠TNF ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7324-88 | |
| 人IFNα ELISA试剂盒 | MabTech | 3425-1H-6 | |
| RNA测序 | Zymo Direct-zol RNA试剂盒 | Zymo | R2052 |
| Illumina NovaSeq测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小RNA去糖基化处理 | PNGase F用量（2 μg）、处理时间（2小时）、温度（37°C）；RNA浓度（30或300 ng）；转染细胞数量和时长 阅读提示：Methods 'RNA stimulation of cells' 小节 |
| 凋亡细胞制备与处理 | 凋亡诱导方法（阿霉素4 μM或紫外线0.24 J cm−2）及处理时间；PNGase F或RNase处理时间；巨噬细胞与凋亡细胞比例 阅读提示：Methods 'In vitro and in vivo efferocytosis assays' 小节 |
| DTWD2敲除实验 | DTWD2 KO U2OS克隆编号；PNGase F处理条件；检测细胞因子类型 阅读提示：Methods 'Cells' 小节及图3图注 |
| 合成acp3U-RNA刺激 | RNA长度和序列（18nt和56nt）；acp3U位置；转染或添加浓度；刺激时间 阅读提示：Methods 'RNA stimulation of cells' 和 'Synthesis and purification of oligonucleotides' 小节 |
| 受体敲除验证 | MyD88、TRIF、TLR3、TLR7敲除小鼠品系；BMDM或腹膜巨噬细胞刺激条件 阅读提示：Methods 'Mice' 和 'Cells' 小节 |