生成区带特异性肝类器官
建立门静脉周围（Z1）和中央静脉周围（Z3）肝类器官模型。
通过诱导Gulo表达（Dox处理）或胆红素处理hiPS细胞衍生的类器官，分别生成Z1-HLOs和Z3-HLOs。
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人多能干细胞来源的多区带肝类器官
Multi-zonal liver organoids from human pluripotent stem cells
实验完整度
高文献包含体外细胞分化、类器官组装、单核RNA测序、表观遗传学分析及体内移植验证等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
人诱导多能干细胞来源的肝类器官 胆管结扎的免疫缺陷RRG大鼠模型 ODS大鼠模型 新鲜分离的人原代肝细胞
重点核对
使用Tet诱导Gulo表达的hiPS细胞系（72.3） 在HCM培养基中添加1 mg/L胆红素处理 Z1-HLO和Z3-HLO共培养比例为1:1 使用胆管结扎的Il2rg缺陷、Rag1缺陷大鼠模型
摘要
不同的肝细胞亚群沿着门静脉-中央静脉轴在空间上分隔，这对于理解肝脏的代谢稳态和损伤至关重要。尽管包括抗坏血酸和胆红素在内的几种生物活性分子已被描述为在指导区带命运中发挥作用，但区带肝脏结构尚未在体外复制。在这里，为了评估肝区带极性，我们通过共培养源自人诱导多能干细胞并经抗坏血酸和胆红素富集的肝祖细胞，开发了一种自组装区带特异性肝类器官。我们发现，预处理的肝细胞样细胞表现出与尿素循环、谷胱甘肽合成和谷氨酸合成相关的区带特异性功能。对这些区带模式化类器官的单核RNA测序分析确定了肝母细胞分化轨迹，该轨迹决定了门静脉周围、区间带和中央静脉周围的人类肝细胞。表观遗传学和转录组学分析表明，区带同一性由抗坏血酸或胆红素依赖的EP300与TET1或HIF1α的结合来协调。将自组装的区带模式化人类类器官移植到接受胆管结扎的免疫缺陷大鼠中，通过改善高氨血症和高胆红素血症提高了其存活率。总体而言，这种多区带类器官系统作为一个体外人类模型，能够更好地重现与肝脏发育和疾病相关的肝脏结构。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 抗坏血酸和胆红素如何驱动肝脏区带分化，以及多区带肝类器官能否重现肝脏区带结构和功能。
- 核心机制
- 抗坏血酸通过TET1、胆红素通过HIF1α介导EP300在增强子区域的结合，从而激活区带特异性基因的表达。
- 主要证据
- 通过对Z1-HLOs和Z3-HLOs的RNA-seq、ChIP-seq和snRNA-seq分析，以及EP300靶基因的验证，支持EP300-TET1/HIF1α机制。
- 研究意义
- 该多区带肝类器官系统为研究肝脏发育、代谢稳态和疾病进展提供了新平台，并可能用于精准治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组装多区带肝类器官
通过共培养Z1-HLOs和Z3-HLOs形成自组装的多区带结构。
将Z1-HLOs（mCherry+）和Z3-HLOs（GFP+）以1:1比例在高密度下共培养，持续给予Dox和胆红素，观察融合。
单核RNA测序分析
解析多区带类器官中的细胞类型和肝细胞分化轨迹。
对mZ-HLOs进行snRNA-seq，分析细胞亚群，并利用RNA velocity和pseudotime分析预测分化轨迹。
机制验证（表观遗传学分析）
揭示抗坏血酸和胆红素如何调控区带特异性基因表达。
进行ChIP-seq分析EP300结合位点，并结合RNA-seq数据鉴定目标转录因子（TET1和HIF1A），并用抑制剂验证功能。
功能验证（代谢和毒性）
验证多区带类器官的区带特异性代谢功能。
检测氮代谢（尿素循环、谷氨酰胺合成）、脂质和葡萄糖代谢，以及对区带特异性毒素的反应。
体内移植验证
评估多区带类器官在体内的治疗效果。
将mZ-HLOs原位移植到胆管结扎的RRG大鼠肝脏，监测存活率、血清白蛋白、胆红素和氨水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Laminin iMatrix-511 Silk | Reprocell | -- |
| StemFit Basic04 Complete Type | Ajinomoto | -- | |
| Y-27632 | Stem Cell Technologies | -- | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | -- | |
| 类器官分化 | 激活素A | Shenandoah Biotechnology | -- |
| 骨形态发生蛋白4 | R&D Systems | -- | |
| 成纤维细胞生长因子4 | Shenandoah Biotechnology | -- | |
| CHIR99021 | PeproTech | -- | |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 视黄酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 肝细胞生长因子 | PeproTech | -- | |
| 制瘤素M | PeproTech | -- | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 类器官诱导 | 胆红素 | -- | -- |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 成像 | BZ-X810荧光显微镜 | Keyence | -- |
| 活细胞成像 | CellDiscoverer 7 | Zeiss | -- |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| SiR-肌动蛋白和SiR-微管蛋白 | Cytoskeleton | CYSC006 | |
| 功能分析 | 胆酰-赖氨酰-荧光素 | Corning | 451041 |
| RNA提取 | RNeasy小量试剂盒 | Qiagen | -- |
| 逆转录 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| qPCR | TaqMan基因表达预混液 | Applied Biosystems | -- |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA测序 | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| ChIP | 高灵敏度ChIP试剂盒 | Abcam | ab185913 |
| EP300抗体 | Abcam | ab14984 | |
| ACSS2抗体 | Abcam | ab133543 | |
| ALDH6A1抗体 | Abcam | ab12618 | |
| Protein A Dynabeads | Invitrogen | 10002D | |
| ChIP-seq | NEB Next Ultra II DNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| snRNA-seq | Nuclei EZ裂解缓冲液 | Sigma-Aldrich | NUC-101 |
| Chromium 3' v3 GEM试剂盒 | 10x Genomics | CG000183RevC | |
| 体内基因沉默 | BLOCK-iT腺病毒RNA干扰表达系统 | Invitrogen | -- |
| ELISA | 人白蛋白ELISA定量试剂盒 | Bethyl Laboratories | -- |
| 小鼠GULO/l-古洛糖酸内酯氧化酶ELISA试剂盒 | MyBioSource.com | MBS2890736 | |
| 代谢物检测 | 胆红素检测试剂盒（总胆红素和直接胆红素，比色法） | Abcam | ab235627 |
| 胆红素检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK126 | |
| 细胞抗氧化检测试剂盒 | Abcam | ab242300 | |
| 谷胱甘肽检测试剂盒 | Abcam | ab65322 | |
| 氨检测试剂盒 | Abcam | ab83360 | |
| 尿素检测试剂盒 | Abcam | ab83362 | |
| 谷氨酰胺检测试剂盒 | Abcam | ab197011 | |
| 葡萄糖检测试剂盒 | Abcam | ab65333 | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Abcam | ab65336 | |
| 代谢活性检测 | P450-Glo CYP3A4检测 | Promega | V8802 |
| P450-Glo CYP1A2检测 | Promega | V8422 | |
| CellTiter-Glo发光细胞活力检测 | Promega | G7572 | |
| 信号通路检测 | 人Notch1通路报告试剂盒 | amsbio | 79503 |
| 双荧光素酶检测系统 | amsbio | 60683-2 | |
| 代谢酶活性检测 | 谷氨酰胺合成酶活性检测试剂盒 | Abcam | ab284572 |
| 谷胱甘肽S转移酶活性检测试剂盒 | Abcam | ab65325 | |
| 脂肪酶活性检测试剂盒 | Abcam | ab102524 | |
| 葡萄糖激酶活性检测试剂盒 | Abcam | ab273303 | |
| 凋亡检测 | Caspase-3检测试剂盒（比色法） | Abcam | ab39401 |
| 血清生化检测 | AST活性检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK055 |
| ALT活性检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK052 | |
| 酶标仪 | BioTek Synergy H1酶标仪 | BioTek | -- |
| 细胞培养 | Stemfit培养基 | Ajinomoto | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| Adv. DMEM/F-12培养基 | Gibco | -- | |
| B27添加剂 | Gibco | -- | |
| N2添加剂 | Gibco | -- | |
| HEPES | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| GA-1000 | Lonza | -- | |
| 肝细胞培养基 | Lonza | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Opti-MEM I培养基 | Gibco | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解和提取缓冲液 | Thermo Scientific | -- |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | -- | |
| 免疫染色 | DAPI | -- | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 正常驴血清 | -- | -- | |
| 成像 | Nikon A1R倒置LUNV共聚焦激光扫描显微镜 | Nikon | -- |
| 动物模型 | 纤维蛋白胶（TISSEEL） | Baxter | -- |
| 动物实验 | SURGICEL SNoW可吸收止血材料 | Ethicon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 生成Z1-HLOs | Gulo诱导：Dox浓度、处理时间，以及hiPS细胞系的选择 阅读提示：Methods: 'Generating mZ-HLOs with zonal diversity' 和 'Gulo-hiPS cell generation' |
| 生成Z3-HLOs | 胆红素浓度和处理时间 阅读提示：Methods: 'Generating mZ-HLOs with zonal diversity' |
| 多区带组装 | 共培养比例、密度、处理条件 阅读提示：Methods: 'Generating mZ-HLOs with zonal diversity' |
| 氮代谢功能验证 | NH4Cl浓度、检测时间点 阅读提示：Results: 'Zone-specific programs work in concert' 和 Methods: 'Metabolite assays' |
| 体内移植 | 动物品系、手术方法、移植细胞数、免疫抑制方案 阅读提示：Methods: 'Organoid transplantation' 和 'Animal experiments' |