建立人小肠ALI类器官模型
验证从内镜活检组织能否培养出保留上皮、间充质和多种免疫细胞的类器官
利用气液界面培养系统，将十二指肠活检碎片接种在胶原基质中，用含WNT3A、EGF、Noggin和R-spondin1的培养基培养，观察并表征类器官生长、细胞组成和免疫多样性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
人类自身免疫类器官模型揭示IL-7在乳糜泻中的作用
A human autoimmune organoid model reveals IL-7 function in coeliac disease
实验完整度
高包含体外类器官模型、患者活检样本、scRNA-seq等多层级验证，并有功能获得和缺失实验明确验证IL-7机制。
主要模型
乳糜泻患者十二指肠ALI类器官 非乳糜泻对照十二指肠ALI类器官
重点核对
HLA-DQ2.5表达状态 麸质肽（DQ2.5-glia-α1/α2）处理浓度和时间 IL-7阻断或重组IL-7处理条件 上皮细胞凋亡检测（cleaved caspase-3, NucView） CD8+ T细胞NKG2C/D表达检测
摘要
自身免疫的体外模型受到无法将受累上皮与复杂的组织驻留免疫微环境共培养的限制。乳糜泻（CeD）是一种自身免疫性疾病，饮食中的麸质衍生肽结合MHC-II分子HLA-DQ2或HLA-DQ8，启动免疫介导的十二指肠黏膜损伤。在此，我们利用内镜活检的完整组织碎片生成了气液界面（ALI）十二指肠类器官，其保留了上皮、天然间充质和组织驻留免疫细胞作为一个整体，无需重建。ALI类器官的免疫多样性涵盖T、B、浆细胞、NK和髓系细胞，具有广泛的T和B细胞受体库。HLA-DQ2.5限制性麸质肽在表达HLA-DQ2.5的CeD患者类器官中选择性引发上皮破坏，这种破坏可被MHC-II或NKG2C/D阻断所拮抗。麸质表位刺激CeD类器官中淋巴和髓系亚群的网络反应，同时产生抗TG2自身抗体。在CeD类器官中的功能研究揭示IL-7是一种新的麸质诱导的致病调节因子，它调节CD8+ T细胞的NKG2C/D表达，并且对于上皮破坏是必要且充分的。此外，与无麸质饮食缓解期疾病相比，活动性CeD患者活检组织中内源性IL-7显著上调，主要位于固有层间充质。通过保留上皮和多种免疫群体，这种人类体外CeD模型概括了麸质依赖性病理，促进了机制研究，并为自身免疫的类器官建模建立了原理验证。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否构建一种保留上皮和保留组织驻留免疫细胞的人类体外乳糜泻模型，并利用该模型阐明麸质诱导上皮损伤的机制？
- 核心机制
- IL-7是麸质诱导的致病调节因子，通过上调CD8+ T细胞的NKG2C/D表达，介导对上皮的杀伤，是上皮破坏所必需且充分的条件。
- 主要证据
- 在HLA-DQ2.5阳性CeD类器官中，麸质肽诱导上皮凋亡和IL-7产生；IL-7阻断消除上皮杀伤，重组IL-7足以诱导杀伤；活动性CeD患者活检中IL-7显著上调。
- 研究意义
- 该人源类器官模型为乳糜泻的机制研究和治疗筛选提供平台，并为自身免疫病的类器官建模提供原理验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
麸质肽处理诱导CeD类器官病理
验证HLA-DQ2.5限制性麸质肽能否在CeD类器官中重现上皮损伤和炎症反应
用脱酰胺的麸质肽（DQ2.5-glia-α1/α2）或对照CLIP肽处理类器官2天，检测上皮凋亡、增殖、IL-15产生和免疫细胞活化。
分析免疫细胞响应
探究麸质肽诱导的免疫细胞亚群变化和细胞间相互作用
通过流式细胞术和scRNA-seq分析处理后的类器官中T细胞、B细胞、NK细胞和髓系细胞的活化状态、受体表达和细胞间通讯。
验证IL-7的功能
阐明IL-7在麸质诱导上皮损伤中的必要性、充分性和机制
通过IL-7R ECD阻断IL-7，或添加重组IL-7，观察对上皮凋亡和CD8+ T细胞NKG2C/D表达的影响。
临床样本验证IL-7表达
验证IL-7在活动性CeD患者活检组织中是否上调
通过免疫荧光和原位杂交检测活动性CeD和缓解期CeD（无麸质饮食）十二指肠活检组织中的IL-7蛋白和mRNA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 类器官培养 | Cultrex大鼠I型胶原 | R&D Systems | 3443-100-01 |
| WENR培养基 | -- | -- | |
| CHIR 99021 | Biogems | 2520691 | |
| 麸质处理 | 麸质肽（DQ2.5-glia-α1/α2） | GenScript | -- |
| CLIP肽 | GenScript | -- | |
| 免疫调节 | 抗HLA-DR、DP、DQ抗体 | BD | 55557 |
| IL-7RA胞外域 | Sino Biological | 10975-H08H | |
| NKG2C胞外域-Fc嵌合体 | R&D Systems | 138-NK-050 | |
| NKG2D胞外域-Fc嵌合体 | R&D Systems | 1299-NK-050 | |
| 重组人IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| 免疫细胞维持 | IL-2 | PeproTech | AF-200-02 |
| 组织学分析 | Keyence BZ-X700显微镜 | Keyence | -- |
| Leica DMC4500显微镜 | Leica | -- | |
| 免疫荧光 | 蔡司LSM900共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| ImageJ | -- | -- | |
| 流式分析 | BD FACSAria-II SORP | BD | -- |
| NucView 488 | Biotium | 30072 | |
| LIVE/DEAD试剂盒 | Invitrogen | L34957 | |
| RT-qPCR | PicoPure RNA提取试剂盒 | Applied Biosystems | KIT0204 |
| iScript逆转录酶 | Bio-Rad | 1708841 | |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | 4367659 | |
| scRNA-seq | Chromium Next GEM单细胞5'试剂盒v2 | 10x Genomics | PN-1000263 |
| Chromium单细胞人TCR扩增试剂盒 | 10x Genomics | PN-1000252 | |
| Chromium单细胞人BCR扩增试剂盒 | 10x Genomics | PN-1000253 | |
| ELISA | 抗人转谷氨酰胺酶IgA检测试剂盒 | Generic Assays | 4033 |
| 原位杂交 | RNAscope探针 - 人IL7 | ACD Biotechne | 424251 |
| RNAscope 2.5 HD双链检测试剂盒 | ACD Biotechne | 322500 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官建立 | 活检来源、HLA-DQ2.5状态、培养时间（9-12天）、培养基成分（WENR） 阅读提示：Methods: Establishment of organoid ALI cultures; 图1a |
| 麸质处理 | 麸质肽浓度（10 μM）和CLIP浓度（10 μM）、处理时间（2天）、培养基（无Y-27632和CHIR99021） 阅读提示：Methods: CeD organoid culture and CLIP or gliadin treatment; 图2 |
| IL-7功能验证 | IL-7R ECD浓度（1 μg/ml）、预处理时间（2天）、重组IL-7浓度（10 ng/ml）、处理时间（4天） 阅读提示：Methods: Immunomodulation treatments; 图5 |
| 免疫检测 | 流式抗体克隆和稀释度（1:500）、凋亡检测试剂（NucView 488）、scRNA-seq平台和建库试剂盒 阅读提示：Methods: Flow cytometry analysis and FACS isolation; Methods: Single-cell RNA-seq; 图3 |
| 临床样本验证 | 活动性CeD和缓解期CeD的诊断标准、活检部位（十二指肠）、IL-7抗体（兔抗IL-7 ab175380 1:400, 鼠抗IL-7 sc-365306 1:100）、RNAscope探针（Hs-IL7, 424251） 阅读提示：Methods: Human specimens; Methods: Immunofluorescence; Methods: In situ hybridization; 图6 |