类玉米花粉驱动通过RNAi引导玉米多样化与驯化

Teosinte Pollen Drive guides maize diversification and domestication by RNAi

作者信息Benjamin Berube, Evan Ernst, Jonathan Cahn, Benjamin Roche, Cristiane de Santis Alves, Jason Lynn, Armin Scheben, Daniel Grimanelli, Adam Siepel, Jeffrey Ross-Ibarra, Jerry Kermicle, Robert A Martienssen
PMID39112710
期刊Nature
发布时间2024-09
DOI10.1038/s41586-024-07788-0

实验完整度

包含遗传杂交、单花粉基因组测序、小RNA测序、CRISPR突变验证及群体基因组分析等多层次证据。

主要模型

玉米-类玉米回交系(TPD) W22近交系 墨西哥类玉米(Zea mays ssp. mexicana) 玉米传统品种和类玉米野生群体

重点核对

TPD系为BC8S3/BC5S2纯合系或BC11-BC13半合系 野生型W22作为对照 花粉败育率统计(75.5% vs 6.02%) PCR及Sanger测序验证dcl2-mu1插入 CRISPR-Cas9敲除Tdr1验证功能

摘要

自私遗传元件导致杂交不亲和并偏向或‘驱动’自身传递。染色体驱动通常在不对称的雌性减数分裂中起作用,而基因驱动通常发生在减数分裂后,且主要在雄性中。在这里,我们利用单分子和单花粉基因组测序,描述了类玉米花粉驱动(Teosinte Pollen Drive),这是玉米与墨西哥类玉米(Zea mays ssp. mexicana)杂交中的一种依赖RNA干扰的基因驱动。来自墨西哥类玉米非编码RNA发夹的22核苷酸小RNA依赖于Dicer-like 2并靶向Teosinte Drive Responder 1,后者编码花粉活力所需的脂肪酶。Dcl2、Tdr1和发夹在5号染色体上紧密假连锁,但仅通过雄性传递。墨西哥类玉米渗入早期栽培玉米被认为对其在整个美洲的地理传播至关重要,而墨西哥类玉米中一个紧密连锁的倒位跨越现代玉米的主要驯化扫描区域。对玉米传统品种和同域墨西哥类玉米种群的调查揭示了至少四条染色体上RNAi所需的不连锁基因之间的相关渗入模式,这些基因在合成杂种的花粉中也受到基因驱动。类玉米花粉驱动可能在玉米驯化和多样化中发挥了重要作用,并为植物和动物生殖系中‘自身’小RNA的普遍存在提供了解释。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
在玉米-类玉米杂交中,是否存在由RNAi介导的花粉基因驱动系统,以及其对玉米驯化和多样化的影响。
核心机制
TPD由墨西哥类玉米来源的Tpd1位点编码的长链发夹RNA经DCL2加工产生22nt hp-siRNA,通过次级siRNA扩增和翻译抑制靶向花粉必需基因Tdr1,导致不含解毒剂的花粉死亡;Dcl2T和Tpd2作为解毒剂抑制次级siRNA产生,维持花粉活力。
主要证据
遗传定位鉴定Tpd1和Tpd2;单花粉基因组测序显示染色体5和6区间过量遗传;小RNA测序发现TPD特异22nt siRNA;CRISPR敲除Tdr1模拟雄性不育表型。
研究意义
该研究揭示了自私遗传元件在植物生殖隔离和驯化中的作用,为生殖系小RNA的广泛存在提供了解释,并可能影响玉米驯化历史的认识。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

遗传杂交与表型鉴定

建立TPD系并确认花粉败育的表型及其遗传模式。

用墨西哥类玉米与玉米W22杂交并回交,筛选稳定花粉败育的BC系,通过I2KI染色和FDA染色评估花粉活力。

2

遗传定位与单花粉测序

鉴定控制花粉败育的遗传位点,并揭示其在花粉中的非孟德尔传递。

利用分子标记进行遗传定位,对单个花粉进行全基因组测序分析,识别过量传递的渗入片段。

3

基因组组装与候选基因鉴定

解析Tpd1和Tpd2区间的基因结构,鉴定候选基因。

对TPD纯合系进行Nanopore长读长测序和Hi-C辅助组装,注释基因,并筛选花粉表达候选基因如Dcl2和Tdr1。

4

小RNA分析与靶标验证

验证TPD相关的22nt siRNA及其对Tdr1的调控。

进行小RNA测序分析,鉴定TPD特异的22nt siRNA,通过iPARE-seq鉴定切割位点,并预测靶标。

5

功能验证

确认Tdr1是TPD致花粉败育的关键靶标。

利用CRISPR-Cas9在玉米中敲除Tdr1,观察突变体花粉表型,并与TPD表型比较。

6

群体遗传学与进化分析

评估TPD相关位点在玉米和类玉米群体中的分布及选择信号。

分析传统品种、类玉米及现代玉米的基因组数据,检测Tdr1靶位点缺失频率和TPD相关区间的渗入模式。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
连接测序基因组DNA试剂盒 (SQK-LSK109)Oxford Nanopore Technologies--
Dovetail Omni-C 试剂盒Dovetail--
蛋白酶K未明确--
TRIzol 试剂未明确--
RNA清洁和浓缩-5试剂盒Zymo ResearchR1013
ezDNase 酶Thermo Fisher11766051
SuperScript IV VILO 预混液Thermo Fisher11756050
PowerUp SYBR Green 预混液Thermo FisherA25741
TruSeq DNA PCR-Free 试剂盒Illumina20015962
REPLI-g 单细胞试剂盒Qiagen150345
基因组DNA清洁和浓缩试剂盒Zymo ResearchD4067
QuantiFluor dsDNA 系统PromegaE2670
TruSeq Nano DNA 高通量试剂盒Illumina20015965
RiboMinus 植物试剂盒Thermo FisherA1083808
NEXTFLEX 快速定向 RNA-seq 试剂盒PerkinElmerNOVA-5138-08
KAPA 文库定量试剂盒RocheKK4824
NEXTFLEX 小RNA测序V3试剂盒PerkinElmerNOVA-5132-06
Dynabeads mRNA 纯化试剂盒Thermo Fisher61006
T4 RNA 连接酶 1New England BiolabsM0204S
RNaseOUT 核糖核酸酶抑制剂Thermo Fisher10777019
RNA Clean XP 磁珠Beckman CoulterA63987
镁离子RNA片段化试剂盒New England BiolabsE6150S
Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1 磁珠Thermo Fisher65601
Klenow 片段New England BiolabsM0210S
AMPure XP SPRI 磁珠Beckman CoulterA63880
NEB Ultra DNA 文库试剂盒New England BiolabsE7370S
Pierce 去污剂兼容型 Bradford 检测试剂盒Thermo Fisher23246
HSP90-2 抗体AgriseraAS11 1629
Precision Plus Protein Dual Xtra 预染标准品Bio-Rad1610377
山羊抗兔 IgG H&L 二抗PhytoABPHY6000
ECL Prime 检测试剂AmershamRPN2236
卢戈氏碘液SigmaL6146-1L
GoTaq G2 Green 预混液PromegaM7822
Quick-DNA 植物/种子小提试剂盒Zymo ResearchD6020

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
植物材料与生长条件
TPD系来源和代数(如BC8S3/BC5S2纯合系或BC11-BC13半合系):必须确认使用正确的遗传材料;环境条件(温室或田间)可能影响表型。
阅读提示:Methods: Plant material and growth conditions
花粉表型分析
花药发育阶段(5mm)的准确判断;染色方法(I2KI、FDA)和操作细节可能影响结果。
阅读提示:Methods: Phenotyping and microscopy; Figure 1
遗传定位与单花粉测序
用于定位的分离群体大小和标记密度;单花粉测序的样本量(TPD 178个,WT 32个)和测序深度。
阅读提示:Methods: Genotyping and marker design, Single-pollen grain sequencing
基因组组装
测序平台(Nanopore、Hi-C)及组装流程参数(如Flye、NextPolish)可能影响组装质量,需确保染色体级别的完整性。
阅读提示:Methods: Nanopore and Hi-C sequencing, TPD genome assembly and annotation
小RNA分析
生物重复数量(WT和TPD各3个,dcl2T和dcl2-mu1各2个);小RNA文库构建试剂盒和测序平台可能影响结果。
阅读提示:Methods: Small RNA sequencing and analysis
功能验证(CRISPR)
CRISPR靶点设计和编辑效率;突变等位基因的纯合性确认(如测序验证)。
阅读提示:Methods: CRISPR-Cas9 targeting; Figure 4
群体遗传学分析
使用的参考基因组(B73)和SNP数据集来源;分析窗口大小(10kb)和统计方法(iHS、FST)参数。
阅读提示:Methods: Detection of selective sweeps in candidate regions associated with TPD