遗传杂交与表型鉴定
建立TPD系并确认花粉败育的表型及其遗传模式。
用墨西哥类玉米与玉米W22杂交并回交,筛选稳定花粉败育的BC系,通过I2KI染色和FDA染色评估花粉活力。
Teosinte Pollen Drive guides maize diversification and domestication by RNAi
包含遗传杂交、单花粉基因组测序、小RNA测序、CRISPR突变验证及群体基因组分析等多层次证据。
玉米-类玉米回交系(TPD) W22近交系 墨西哥类玉米(Zea mays ssp. mexicana) 玉米传统品种和类玉米野生群体
TPD系为BC8S3/BC5S2纯合系或BC11-BC13半合系 野生型W22作为对照 花粉败育率统计(75.5% vs 6.02%) PCR及Sanger测序验证dcl2-mu1插入 CRISPR-Cas9敲除Tdr1验证功能
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立TPD系并确认花粉败育的表型及其遗传模式。
用墨西哥类玉米与玉米W22杂交并回交,筛选稳定花粉败育的BC系,通过I2KI染色和FDA染色评估花粉活力。
鉴定控制花粉败育的遗传位点,并揭示其在花粉中的非孟德尔传递。
利用分子标记进行遗传定位,对单个花粉进行全基因组测序分析,识别过量传递的渗入片段。
解析Tpd1和Tpd2区间的基因结构,鉴定候选基因。
对TPD纯合系进行Nanopore长读长测序和Hi-C辅助组装,注释基因,并筛选花粉表达候选基因如Dcl2和Tdr1。
验证TPD相关的22nt siRNA及其对Tdr1的调控。
进行小RNA测序分析,鉴定TPD特异的22nt siRNA,通过iPARE-seq鉴定切割位点,并预测靶标。
确认Tdr1是TPD致花粉败育的关键靶标。
利用CRISPR-Cas9在玉米中敲除Tdr1,观察突变体花粉表型,并与TPD表型比较。
评估TPD相关位点在玉米和类玉米群体中的分布及选择信号。
分析传统品种、类玉米及现代玉米的基因组数据,检测Tdr1靶位点缺失频率和TPD相关区间的渗入模式。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因组组装 | 连接测序基因组DNA试剂盒 (SQK-LSK109) | Oxford Nanopore Technologies | -- |
| Dovetail Omni-C 试剂盒 | Dovetail | -- | |
| DNA提取 | 蛋白酶K | 未明确 | -- |
| RNA提取 | TRIzol 试剂 | 未明确 | -- |
| RNA清洁和浓缩-5试剂盒 | Zymo Research | R1013 | |
| RT-qPCR | ezDNase 酶 | Thermo Fisher | 11766051 |
| SuperScript IV VILO 预混液 | Thermo Fisher | 11756050 | |
| PowerUp SYBR Green 预混液 | Thermo Fisher | A25741 | |
| 全基因组测序 | TruSeq DNA PCR-Free 试剂盒 | Illumina | 20015962 |
| 单花粉测序 | REPLI-g 单细胞试剂盒 | Qiagen | 150345 |
| 基因组DNA清洁和浓缩试剂盒 | Zymo Research | D4067 | |
| QuantiFluor dsDNA 系统 | Promega | E2670 | |
| TruSeq Nano DNA 高通量试剂盒 | Illumina | 20015965 | |
| RNA-seq | RiboMinus 植物试剂盒 | Thermo Fisher | A1083808 |
| NEXTFLEX 快速定向 RNA-seq 试剂盒 | PerkinElmer | NOVA-5138-08 | |
| KAPA 文库定量试剂盒 | Roche | KK4824 | |
| 小RNA测序 | NEXTFLEX 小RNA测序V3试剂盒 | PerkinElmer | NOVA-5132-06 |
| iPARE-seq | Dynabeads mRNA 纯化试剂盒 | Thermo Fisher | 61006 |
| T4 RNA 连接酶 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| RNaseOUT 核糖核酸酶抑制剂 | Thermo Fisher | 10777019 | |
| RNA Clean XP 磁珠 | Beckman Coulter | A63987 | |
| 镁离子RNA片段化试剂盒 | New England Biolabs | E6150S | |
| Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1 磁珠 | Thermo Fisher | 65601 | |
| Klenow 片段 | New England Biolabs | M0210S | |
| AMPure XP SPRI 磁珠 | Beckman Coulter | A63880 | |
| NEB Ultra DNA 文库试剂盒 | New England Biolabs | E7370S | |
| 蛋白质印迹 | Pierce 去污剂兼容型 Bradford 检测试剂盒 | Thermo Fisher | 23246 |
| HSP90-2 抗体 | Agrisera | AS11 1629 | |
| Precision Plus Protein Dual Xtra 预染标准品 | Bio-Rad | 1610377 | |
| 山羊抗兔 IgG H&L 二抗 | PhytoAB | PHY6000 | |
| ECL Prime 检测试剂 | Amersham | RPN2236 | |
| 花粉染色 | 卢戈氏碘液 | Sigma | L6146-1L |
| 基因分型 | GoTaq G2 Green 预混液 | Promega | M7822 |
| Quick-DNA 植物/种子小提试剂盒 | Zymo Research | D6020 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 植物材料与生长条件 | TPD系来源和代数(如BC8S3/BC5S2纯合系或BC11-BC13半合系):必须确认使用正确的遗传材料;环境条件(温室或田间)可能影响表型。 阅读提示:Methods: Plant material and growth conditions |
| 花粉表型分析 | 花药发育阶段(5mm)的准确判断;染色方法(I2KI、FDA)和操作细节可能影响结果。 阅读提示:Methods: Phenotyping and microscopy; Figure 1 |
| 遗传定位与单花粉测序 | 用于定位的分离群体大小和标记密度;单花粉测序的样本量(TPD 178个,WT 32个)和测序深度。 阅读提示:Methods: Genotyping and marker design, Single-pollen grain sequencing |
| 基因组组装 | 测序平台(Nanopore、Hi-C)及组装流程参数(如Flye、NextPolish)可能影响组装质量,需确保染色体级别的完整性。 阅读提示:Methods: Nanopore and Hi-C sequencing, TPD genome assembly and annotation |
| 小RNA分析 | 生物重复数量(WT和TPD各3个,dcl2T和dcl2-mu1各2个);小RNA文库构建试剂盒和测序平台可能影响结果。 阅读提示:Methods: Small RNA sequencing and analysis |
| 功能验证(CRISPR) | CRISPR靶点设计和编辑效率;突变等位基因的纯合性确认(如测序验证)。 阅读提示:Methods: CRISPR-Cas9 targeting; Figure 4 |
| 群体遗传学分析 | 使用的参考基因组(B73)和SNP数据集来源;分析窗口大小(10kb)和统计方法(iHS、FST)参数。 阅读提示:Methods: Detection of selective sweeps in candidate regions associated with TPD |