临床队列CRP与生存分析
评估基线CRP水平及治疗中CRP变化与转移性膀胱癌患者总生存期的关系。
分析IMvigor210、IMvigor211、IMvigor130和HCRN GU14-182队列的CRP数据，进行生存分析。
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促肿瘤炎症SPP1+巨噬细胞-IL-6-CRP轴驱动膀胱癌免疫功能障碍
A Tumor-Promoting Inflammatory SPP1+ Macrophage-IL6-CRP Axis Drives Immune Dysfunction in Bladder Cancer
实验完整度
高包含scRNA-seq、批量RNA-seq、空间转录组、RNAscope、多重免疫组化、体外巨噬细胞-T细胞共培养及功能实验等多层级验证。
主要模型
人膀胱癌肿瘤组织及配对癌旁组织 健康供者外周血单核细胞来源的巨噬细胞 THP-1单核细胞系来源的巨噬细胞 原代CD8+和CD4+ T细胞 NY-ESO-1特异性Jurkat 76 T细胞
重点核对
血浆CRP和IL-6水平与ICB治疗队列的总生存期关联 SPP1+与CXCL9+巨噬细胞的比例（CXCL9:SPP1比值）与ICB治疗OS的相关性 IL-1β和IFNγ对单核细胞来源巨噬细胞极化的影响 SPP1+巨噬细胞通过IL-6信号抑制CD8+和CD4+ T细胞效应功能 IL-6在T细胞中诱导SOCS3表达
摘要
免疫检查点阻断（ICB）已彻底改变尿路上皮膀胱癌（UC）的治疗，但反应率仍然有限。炎症促进疾病进展和治疗耐药，巨噬细胞塑造肿瘤微环境（TME）。虽然血液C反应蛋白（CRP）升高与UC不良临床结局相关，但其与TME的关系仍不清楚。在此，我们表明血浆IL-6和CRP升高与多个ICB治疗队列中肿瘤巨噬细胞浸润增加相关。对迄今为止最大的UC图谱进行单细胞RNA测序，并与批量RNA测序整合，在血浆IL-6高的患者TME中鉴定出免疫抑制性SPP1+巨噬细胞的富集。空间和功能分析表明，SPP1+巨噬细胞部分通过IL-6信号传导抑制T细胞活性，而CXCL9+巨噬细胞促进T细胞激活。这些发现将全身性炎症与局部免疫功能障碍联系起来，并定义了一个与ICB耐药相关的巨噬细胞驱动轴，以及改善UC免疫治疗结果的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 血浆CRP和IL-6升高与膀胱癌肿瘤微环境中巨噬细胞浸润及其功能状态的关系，以及这种关系如何影响免疫检查点阻断治疗反应。
- 核心机制
- SPP1+巨噬细胞通过IL-6信号传导抑制T细胞效应功能，部分通过上调SOCS3实现，而CXCL9+巨噬细胞促进T细胞激活；IL-1β驱动SPP1+巨噬细胞极化，IFNγ驱动CXCL9+巨噬细胞极化。
- 主要证据
- scRNA-seq和批量RNA-seq显示SPP1+巨噬细胞在IL-6高组富集，体外共培养证明SPP1+巨噬细胞抑制T细胞功能，IL-6阻断部分恢复T细胞功能，空间转录组显示SPP1+巨噬细胞与T细胞空间分离。
- 研究意义
- 研究定义了与ICB耐药相关的巨噬细胞驱动轴，并提出靶向IL-1β/IL-6轴或SPP1+巨噬细胞表面标志物（如CLEC5A、TREM1）的潜在治疗策略，以改善膀胱癌免疫治疗效果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
血浆IL-6与CRP相关性及TME特征分析
探讨血浆IL-6与CRP的相关性，并鉴定与高IL-6相关的肿瘤微环境特征。
使用Olink平台测量92种血浆蛋白，分析IL-6与CRP相关性；对IMvigor210的bulk RNA-seq数据进行差异表达基因和基因集富集分析。
单细胞RNA测序图谱构建
高分辨率解析膀胱癌肿瘤微环境中的巨噬细胞亚群。
对42个膀胱肿瘤样本和6个配对癌旁组织进行scRNA-seq，整合公共数据，构建包含50个肿瘤的图谱。
巨噬细胞亚群功能表征
验证SPP1+和CXCL9+巨噬细胞在TME中的功能差异。
通过bulk RNA-seq、RT-qPCR、流式细胞术、ELISA等方法分析IL-1β和IFNγ对单核细胞来源巨噬细胞极化的影响，并检测其分泌的细胞因子。
体外巨噬细胞-T细胞共培养
评估SPP1+和CXCL9+巨噬细胞对T细胞功能的影响。
将IL-1β或IFNγ极化的巨噬细胞与naïve CD8+或CD4+ T细胞共培养，检测T细胞效应功能（IFNγ、TNFα、granzyme B）和增殖。
IL-6信号阻断实验
验证IL-6是否介导SPP1+巨噬细胞对T细胞的抑制效应。
在共培养体系中加入tocilizumab（IL-6受体阻断抗体）或对照，检测T细胞功能变化。
空间转录组和空间分析
研究SPP1+和CXCL9+巨噬细胞与T细胞在组织中的空间关系。
使用Visium空间转录组和多重免疫组化（mIHC）分析，结合MARQO分析工具，评估巨噬细胞亚群与CD8+ T细胞的共定位。
临床结局关联分析
验证巨噬细胞亚群比例与ICB治疗总生存期的关系。
在IMvigor210和Caris RWD队列中，计算CXCL9:SPP1比值与OS的关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 临床样本CRP检测 | 高敏CRP ELISA试剂盒 | R&D Systems | DCRP00 |
| 血浆细胞因子检测 | Olink Target 96 炎症面板 | Olink | -- |
| 血浆IL-1β检测 | 人IL-1β/IL-1F2 QuicKit ELISA试剂盒 | R&D Systems | QK201 |
| RNAscope原位杂交 | RNAscope 2.5 LS 双链试剂盒 | ACD Bio-Techne | 322430 |
| RNAscope探针 | RNAscope 2.5 LS 探针 Hs-IL6-C1 | ACD Bio-Techne | 310378-C1 |
| RNAscope 2.5 LS 探针 Hs-CXCL9-C2 | ACD Bio-Techne | 440168-C2 | |
| 组织解离 | 人肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
| gentleMACS解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| 细胞分离 | Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-03 |
| 细胞培养 | Gibco RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875-093 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 16000044 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher | A2916801 | |
| 巨噬细胞分化 | 重组人M-CSF | Peprotech | 300-25 |
| 巨噬细胞极化 | 重组人IL-1β | Peprotech | 200-01B |
| 重组人IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
| 超纯脂多糖 | InvivoGen | tlrl-smlps | |
| 重组人TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| 佛波酯 | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| 重组人EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| 药物处理 | CA-4948 | TargetMol | T9027 |
| 重组人IL-1RA | Biolegend | 553906 | |
| 共培养 | 托珠单抗 | Selleck Chemicals | A2012 |
| Ultra-LEAF纯化人IgG1同型对照 | Biolegend | 403501 | |
| T细胞分离 | EasySep人初始CD8+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19258 |
| EasySep人初始CD4+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19555 | |
| T细胞激活 | Dynabeads人T细胞激活剂CD3/CD28 | Gibco | 11131D |
| T细胞功能检测 | 重组人IL-6 | Peprotech | 200-06 |
| 重组人SPP1 | Peprotech | 120-35 | |
| 重组人CRP | Invitrogen | RP75528 | |
| 细胞因子检测 | LEGENDplex人巨噬细胞/小胶质细胞检测试剂盒 | Biolegend | 740502 |
| 人CRP ELISA试剂盒 | R&D Systems | DCRP00 | |
| 人IL-6 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher | EH2IL6 | |
| 人MIG/CXCL9 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher | EHCXCL9 | |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD固定死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher | L34957 |
| 人TruStain FcX | Biolegend | 422302 | |
| CytoFix/CytoPerm试剂 | BD | 554714 | |
| Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher | -- | |
| FlowJo软件 | BD | -- | |
| 单细胞转录组 | 10x Genomics Chromium 单细胞3'和5'基因表达V3 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq S4流动槽 | Illumina | -- | |
| 空间转录组 | Visium CytAssist | 10x Genomics | -- |
| EVOS M7000显微镜 | Thermo Fisher | -- | |
| QuantStudio 5 | Thermo Fisher | -- | |
| D1000 Agilent Tapestation试剂盒 | Agilent | -- | |
| Agilent 4200 Tapestation系统 | Agilent | -- | |
| RNAscope检测 | Leica BOND RX自动染色仪 | Leica | -- |
| Bond Polymer Refine Red检测试剂盒 | Leica | DS9390 | |
| 免疫组化 | Ventana Discovery Ultra自动染色仪 | Roche | -- |
| CD68抗体（克隆号KP-1） | Roche | 05278252001 | |
| OmniMAP HRP抗鼠二抗 | Roche | 760-4310 | |
| Discovery Yellow HRP试剂盒 | Roche | 760-250 | |
| DAB显色剂 | Ventana | -- | |
| OmniMap Purple | Ventana | -- | |
| Teal显色剂 | Ventana | -- | |
| SPP1抗体 | Millipore Sigma | HPA027541 | |
| HLA-DR抗体（克隆号TAL.1B5） | Agilent | M0746 | |
| CD8抗体（克隆号SP57） | Roche | 790-4460 | |
| 广谱细胞角蛋白抗体（克隆号AE1/AE3） | Abcam | ab27988 | |
| RNA提取 | Qiagen RNeasy FFPE试剂盒 | Qiagen | -- |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| Direct-zol RNA微量制备试剂盒 | Zymo Research | R2060 | |
| RT-qPCR | cDNA EcoDry Premix双引物预混试剂盒 | Clontech | 639549 |
| TaqMan Fast Advanced预混液 | Thermo Fisher | 4444556 | |
| CFX384 Touch实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 转录组测序 | Cell Ranger单细胞软件套件 | 10x Genomics | -- |
| 数据分析 | Seurat | -- | -- |
| DESeq2 | -- | -- | |
| msigdbr | -- | -- | |
| FGSEA | -- | -- | |
| STAR比对器 | -- | -- | |
| Salmon | -- | -- | |
| DoubletFinder | -- | -- | |
| spacexr | -- | -- | |
| AUCell | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRP与生存分析 | 血浆CRP水平测量方法（不同队列可能不同）、基线CRP分组方式（四分位数）、治疗中CRP变化定义（C3D1或C4D1）、ICB或化疗治疗方案。 阅读提示：Methods: Clinical trial sample collection for CRP analysis; Baseline CRP and CRP dynamic analysis; Figure 2 legend |
| 血浆细胞因子分析 | Olink panel版本、血液样本处理、NPX计算方式、健康对照定义。 阅读提示：Methods: Olink, Target 96 Panel; Figure 3 legend |
| 单细胞RNA测序 | 组织来源（TURBT或膀胱切除术）、解离方案、10X平台（3'或5'）、测序深度、质量过滤标准（线粒体基因比例、UMI数）、整合方法。 阅读提示：Methods: Dissociation of bladder tissue to single-cell suspensions; scRNA-seq; Raw data processing, quality control, and Seurat analysis of scRNA-seq |
| 巨噬细胞极化 | 单核细胞分离方法（CD14磁珠）、M-CSF浓度和培养时间、极化细胞因子（IL-1β或IFNγ）浓度和时间、CLEC5A和TREM1检测方法。 阅读提示：Methods: Screen of upstream ligands on healthy donor blood monocyte-derived Macs; Methods: Drug treatment of modelled SPP1+ Macs; Figure 5 legend |
| 共培养实验 | 巨噬细胞与T细胞比例、共培养时间、T细胞激活方式（抗CD3/CD28）、效应功能检测（IFNγ、TNFα、granzyme B）、增殖检测方法（CFSE）。 阅读提示：Methods: Co-culture of in vitro modelled Macs and CD8+ and CD4+ T cells; Figure 6 legend |
| IL-6阻断实验 | tocilizumab浓度、对照抗体（hIgG1）、加入时间、共培养条件。 阅读提示：Methods: Tocilizumab treatment during macrophage and CD8+ T cells co-culture; Figure 7 legend |
| 空间转录组 | Visium切片制备（固定、包埋、切片厚度）、ROI选择、基因表达数据去卷积方法（RCTD）、空间共定位分析方法。 阅读提示：Methods: Visium CytAssist Spatial Gene Expression Assay; Spatial localization of Mac and T cell subtypes and hypoxia signature; Figure 4 legend |
| 临床结局关联分析 | 队列选择（IMvigor210、Caris等）、样本类型（原发或转移）、RNA-seq数据类型（TPM或FPKM）、CXCL9:SPP1比值计算方法、OS定义和统计模型。 阅读提示：Methods: CXCL9:SPP1 and macrophage marker gene ratio analysis; Figure 4 legend |