建立电子平衡模型
通过计算代谢转化的电子产生或消耗来预测细胞代谢重编程的策略。
基于电子守恒定律，定义代谢物的还原度Y，并建立电子平衡模型Φ(δ)=0。
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抑制脯氨酸生物合成和脂质生成协同抑制肿瘤生长
Inhibiting both proline biosynthesis and lipogenesis synergistically suppresses tumor growth
实验完整度
高包含体外细胞代谢示踪、P5CS基因敲除、体内移植瘤和转基因小鼠模型等多个证据层级，且通过回补和抑制剂实验验证机制。
主要模型
HeLa细胞系 4T1细胞系 P5CS条件敲除小鼠 MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型
重点核对
低氧条件：0.5%氧气 电子传递链抑制剂：抗霉素A（1 μM） P5CS敲除细胞系（HeLa/P5CS-KO和4T1/P5CS-KO） ACC1抑制剂PF-05175157（5或10 μM） HMGR抑制剂洛伐他汀（1 μM）
摘要
癌细胞常在低氧条件下增殖并重新编程其代谢。然而，如何找到有效阻断低氧相关代谢途径的靶点仍不清楚。在这里，我们开发了一种工具，可以方便地计算代谢转化中耗散的电子的数量。基于化学反应中电子守恒定律，我们进一步建立了中心碳代谢的电子平衡模型，它可以准确描绘低氧下的代谢可塑性。我们的模型表明，为脂质和/或脯氨酸生物合成而重编程的谷氨酰胺代谢实际上充当了替代电子库，使得增殖细胞在低氧下能够进行电子转移。同时抑制脯氨酸生物合成和脂肪生成可以协同抑制低氧下癌细胞生长和体内肿瘤发生。因此，我们的模型有助于揭示通过阻断低氧重编程代谢来抑制肿瘤生长的潜在靶点组合，并为未来癌症代谢研究提供了有用的工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 癌细胞在低氧条件下如何通过代谢重编程来维持电子转移并支持增殖，以及能否通过靶向这些代谢途径抑制肿瘤生长？
- 核心机制
- 低氧或电子传递链抑制导致电子积累，促进谷氨酰胺通过还原性羧化进行脂质合成和脯氨酸生物合成作为替代电子库；同时抑制脯氨酸生物合成和脂肪生成可协同抑制低氧下癌细胞生长和体内肿瘤发生。
- 主要证据
- 通过同位素示踪证明低氧和抗霉素A促进谷氨酰胺来源的脯氨酸和脂肪酸合成；P5CS敲除或ACC1抑制分别诱导另一途径的补偿性上调；在4T1和HeLa异种移植瘤模型中，P5CS敲除联合PF-05175157和洛伐他汀显著抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 研究提供了一种靶向低氧重编程代谢的联合治疗策略，可能为实体瘤的广谱治疗提供新的靶点组合。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外低氧或ETC抑制下的代谢重编程验证
验证低氧或ETC抑制下细胞代谢是否符合模型预测的电子平衡策略。
使用HeLa和4T1细胞，在低氧（0.5% O2）或抗霉素A处理下，进行13C-葡萄糖和13C-谷氨酰胺示踪，检测糖酵解、PPP（磷酸戊糖途径）、还原性羧化、脯氨酸合成和脂质合成相关的代谢物标记及水平。
验证电子积累驱动代谢重编程
检验电子积累是否作为代谢重编程的驱动力。
使用α-酮丁酸降低NADH/NAD+比值，检测低氧下脯氨酸合成和脂质生成的标记变化。
P5CS敲除和ACC1抑制的补偿性验证
验证脯氨酸合成和脂肪生成在低氧下是否互相补偿。
通过CRISPR/Cas9敲除HeLa和4T1细胞的P5CS，或用ACC1抑制剂PF-05175157处理，检测细胞增殖和代谢标记变化。
体内肿瘤生长抑制验证
验证同时抑制脯氨酸合成和脂肪生成能否抑制体内肿瘤生长。
将P5CS敲除和对照的4T1和HeLa细胞接种到裸鼠，使用PF-05175157和洛伐他汀单独或联合处理，测量肿瘤体积。
转基因小鼠模型验证
评估P5CS缺失对正常发育和肿瘤发生的影响。
利用CRISPR/Cas9生成P5CSfl/fl小鼠，与EIIa-Cre小鼠杂交获得P5CSΔ/Δ小鼠，再与MMTV-PyMT小鼠杂交，观察肿瘤发生。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞增殖检测
基因编辑
蛋白表达检测
转录组分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 人血浆样培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | BioInd | -- | |
| 代谢物示踪 | [U-13C]-葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories | -- |
| [1,6-13C]-葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| [3-2H]-葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| [U-13C]-谷氨酰胺 | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| 药物处理 | PF-05175157 | ChemicalBook | -- |
| 洛伐他汀 | MedChem Express | -- | |
| 细胞增殖检测 | Hoechst 33345 | -- | -- |
| Cell Titer-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | 7570 | |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-lg |
| 抗HIF1α抗体 | Proteintech | 20960-1-AP | |
| 抗GOT1抗体 | Proteintech | 14886-1-AP | |
| 抗GOT2抗体 | Proteintech | 14800-1-AP | |
| 抗MDH1抗体 | Proteintech | 15904-1-AP | |
| 抗MDH2抗体 | Proteintech | 15462-1-AP | |
| 抗P5CS抗体 | Proteintech | 17719-1-AP | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Li-Cor | P/N | |
| 代谢物分析 | TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Dionex UltiMate 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Synergi Hydro-RP 100A 2.1 × 100-mm色谱柱 | Phenomenex | -- | |
| 脂质分析 | Cortecs C18色谱柱 | Waters | -- |
| 非靶向代谢组学 | 1290 Infinity液相色谱 | Agilent Technologies | -- |
| TripleTOF 6600 | AB Sciex | -- | |
| ACQUIY UPLC BEH 1.7-µm色谱柱 | Waters | -- | |
| 代谢物浓度测定 | M-100自动生物传感器分析仪 | Shenzhen Siemen Technology Co., Ltd | -- |
| NADH/NAD+测定 | NAD/NADH-Glo检测试剂盒 | Promega | G9072 |
| NADPH/NADP+测定 | NADP/NADPH-Glo检测试剂盒 | Promega | G9082 |
| 读数 | Synergy H1多功能酶标仪 | BioTek | -- |
| 显微成像 | NIS-element AR Nikon ECLIPSE Ti显微镜 | Nikon | -- |
| 转染 | Lipofectamine-3000 | Invitrogen | -- |
| 动物实验 | 雌性裸鼠 | Experimental Animal Center of Nanjing Biomedical Research Institute | -- |
| RNA-seq | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| Illumina Hiseq 4000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与低氧处理 | 细胞系来源，培养基（DMEM或HPLM）成分，培养气体条件，低氧浓度（0.5% O2），处理时间（8-48小时） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture, Metabolite isotope tracing |
| ETC抑制处理 | 抗霉素A使用浓度（1 μM），处理时间（8小时） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture，图例 |
| 代谢物示踪 | 同位素标记底物（[U-13C]-葡萄糖、[U-13C]-谷氨酰胺等），标记物浓度，标记时间（8小时或48小时），培养基中标记底物与未标记底物的比例 阅读提示：Materials and methods: Metabolite isotope tracing |
| 细胞增殖实验 | 细胞接种密度（2×10^3或1×10^5），培养板规格（24孔或12孔），处理条件（低氧或抗霉素A），处理时间（3天或7天） 阅读提示：Materials and methods: Cell proliferation assay |
| P5CS基因敲除 | sgRNA序列，转染方法（Lipofectamine-3000），单克隆筛选方法（流式分选），敲除验证（Western blot和测序） 阅读提示：Materials and methods: Generation of P5CS-knockout cell lines |
| 体内肿瘤实验 | 细胞注射数量（2×10^6），注射部位（皮下腹股沟），药物剂量（PF-05175157 50或100 mg/kg，洛伐他汀15或30 mg/kg），给药途径（腹腔注射），给药频率（每日或每隔一日），治疗开始时间（肿瘤体积约80 mm^3） 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments |