样本收集与单细胞多组学数据生成
获取ccRCC肿瘤样本并进行scRNA-seq和scATAC-seq测序，以构建单细胞转录组和染色质可及性图谱。
从19例ccRCC患者获取肿瘤样本，制备单细胞悬液，进行scRNA-seq和scATAC-seq测序，同时进行WES分析。
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整合单细胞分析揭示透明细胞肾细胞癌的转录和表观遗传调控特征
Integrative Single-Cell Analysis Reveals Transcriptional and Epigenetic Regulatory Features of Clear Cell Renal Cell Carcinoma
实验完整度
高包含多个独立证据层次：scRNA-seq与scATAC-seq单细胞多组学、WES、体外细胞功能实验（ASO敲低、增殖、迁移、侵袭）、蛋白质质谱及机制验证。
主要模型
786-O细胞系 Caki-2细胞系 19例ccRCC患者肿瘤样本
重点核对
ASO-5608和ASO-5717的靶向特异性及敲低效率（qRT-PCR验证） CCK-8增殖实验处理时间（24、48、72小时） Transwell侵袭实验细胞数量（6×10^4）和孵育时间（24小时） Western blot中E-cadherin抗体浓度（1:5000）和GAPDH抗体浓度（1:5000） scATAC-seq质量控制参数（峰区片段数1000-20000、黑名单比例<0.05、核小体信号<4、TSS富集分数>1）
摘要
透明细胞肾细胞癌（ccRCC）常表现出高度的肿瘤异质性。在单细胞水平阐明ccRCC的染色质景观，可以更深入地理解该疾病的功能状态和调控动态。在这里，我们对19例ccRCC样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC-seq），并使用全外显子测序来了解个体之间的异质性。构建了ccRCC的单细胞转录组和染色质可及性图谱，揭示了ccRCC中不同肿瘤细胞亚型的调控特征。鉴定出两个长链非编码RNA（RP11-661C8.2和CTB-164N12.1），它们促进ccRCC的侵袭和迁移，并通过体外实验进行了验证。总之，本研究全面表征了ccRCC的基因表达和DNA调控图谱，这可能为ccRCC的生物学和治疗提供新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ccRCC在单细胞水平上的基因表达和染色质可及性特征如何，以及这些特征如何揭示肿瘤细胞亚型的调控机制？
- 核心机制
- 通过scATAC-seq发现两个肿瘤细胞特异性lncRNA RP11-661C8.2和CTB-164N12.1，在体外促进ccRCC侵袭和迁移，其调控可能通过结合特定蛋白如TMP1、TMP4等实现，但具体机制尚未完全阐明。
- 主要证据
- scRNA-seq和scATAC-seq分析鉴定出肿瘤细胞亚型及其染色质可及性差异；ASO敲低实验证实敲低RP11-661C8.2和CTB-164N12.1后，ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭能力下降，E-cadherin表达升高；蛋白质质谱鉴定出可能与这些lncRNA结合的蛋白。
- 研究意义
- 本研究全面描述了ccRCC的基因表达和DNA调控图谱，发现并验证了促进肿瘤细胞侵袭和迁移的lncRNA，为ccRCC的治疗提供了新的见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组分析
鉴定ccRCC中的细胞类型和肿瘤细胞亚型，并分析其基因表达特征。
对scRNA-seq数据质控、归一化、批次效应去除、聚类，并通过差异表达基因、CNV分析、RNA velocity和Monocle3轨迹分析等，鉴定出4个肿瘤细胞亚型。
单细胞染色质可及性分析
构建ccRCC的单细胞染色质可及性图谱，并鉴定细胞类型特异的调控元件。
对scATAC-seq数据质控、合并样本、聚类，通过基因活性分数、细胞类型特异性峰和转录因子分析，鉴定出29种细胞类型及16个肿瘤细胞亚型。
整合scRNA-seq和scATAC-seq
将转录组和染色质可及性数据整合，揭示肿瘤细胞亚型的调控关系。
使用Seurat和Signac整合scRNA-seq和scATAC-seq数据，通过基因活性分数和典型相关分析转移注释，构建共嵌入图谱，分析肿瘤细胞亚型间的染色质可及性与基因表达关联。
发现肿瘤细胞特异性lncRNA并验证功能
鉴定肿瘤细胞特异性的lncRNA，并验证其生物学功能。
通过scATAC-seq发现四个肿瘤细胞特异性lncRNA，选择RP11-661C8.2和CTB-164N12.1进行功能验证，使用ASO敲低后检测细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期。
蛋白质质谱鉴定lncRNA相互作用蛋白
鉴定与RP11-661C8.2和CTB-164N12.1相互作用的蛋白质，以探索其调控机制。
通过RNA pull-down富集与lncRNA结合的蛋白质，并进行蛋白质质谱分析，鉴定出多种候选相互作用蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞转录组分析
分子机制验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | WISENT | 350-006-CL |
| McCoy's 5A培养基 | Procell | PM150710A | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 支原体检测试剂盒 | Vazyme | D101-01 | |
| 单细胞悬液制备 | Hanks平衡盐溶液 | Gibco | 24020117 |
| 组织消化 | I型胶原酶 | Gibco | 5401020001 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | 10104159001 | |
| 组织消化终止 | DMEM培养基 | WISENT | 319-006-CL |
| 红细胞去除 | 红细胞裂解液 | BioLegend | 420301 |
| 细胞计数 | 台盼蓝 | Gibco | 15250-061 |
| scATAC-seq | 细胞核缓冲液 | 10x Genomics | 2000153 |
| ATAC缓冲液 | 10x Genomics | 200122 | |
| ATAC酶 | 10x Genomics | 200123 | |
| 条形码试剂B | 10x Genomics | 2000194 | |
| 还原剂B | 10x Genomics | 2000087 | |
| 条形码酶 | 10x Genomics | 2000125 | |
| Chromium芯片E | 10x Genomics | 2000121 | |
| 分离油 | 10x Genomics | 220088 | |
| Chromium单细胞ATAC凝胶微珠 | 10x Genomics | 2000132 | |
| 10x垫片 | 10x Genomics | 3000072 | |
| Dynabeads磁珠 | 10x Genomics | 2000048 | |
| SPRIselect磁珠 | Beckman Coulter | B23318 | |
| 单索引试剂盒N套件A | 10x Genomics | 1000212 | |
| WES | SureSelect人全外显子试剂盒 | Agilent | 5191-7411 |
| Bulk ATAC-seq | TruePrep DNA文库制备试剂盒V2（Illumina） | Vazyme | TD501-01 |
| 2× VAHTS DNA纯化磁珠 | Vazyme | N411 | |
| TruePrep索引试剂盒V2（Illumina） | Vazyme | TD202 | |
| qRT-PCR | Ambion PARIS试剂盒 | Invitrogen | AM1921 |
| HiScript II Q RT SuperMix（用于qPCR，含gDNA去除） | Vazyme | R223 | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6924204001 | |
| Light Cycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| ASO设计 | ASO-5717 | RiBoBio | ASO-h-ENST00000518605_001 |
| ASO-5608 | RiBoBio | ASO-h-ENST00000507989_001 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Vazyme | A311-01 |
| Cell Light EdU Apollo 488体外试剂盒 | RiBoBio | C10338-1 | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | BD | 556547 |
| 细胞周期检测 | 细胞周期染色试剂盒 | MultiSciences | 70-CCS012 |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | 3422 |
| 结晶紫染色液 | Solarbio | G1063 | |
| RNA pull-down | RNA pull-down试剂盒 | BersinBio | Bes5102 |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | P1045-1 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime | P1045-2 | |
| BSA定量试剂盒 | Beyotime | P0010S | |
| SDS-PAGE试剂盒 | Sangon Biotech | C631100 | |
| 转膜缓冲液 | Sangon Biotech | C520039 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Biosharp | BS-PVDF-22 | |
| 封闭液 | Beyotime | P0252 | |
| Tris缓冲盐溶液/Tween 20 | Sangon Biotech | C520009 | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Thermo Fisher Scientific | 701134 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| 二抗（山羊抗兔） | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 二抗（山羊抗小鼠） | Solarbio | SE131 | |
| ECL化学发光试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 34577 | |
| ImageQuant LAS 500成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| 细胞培养 | 786-O细胞系 | Procell | CL-0010 |
| Caki-2细胞系 | Procell | CL-0326 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞悬液制备 | 组织消化时间（30分钟）、胶原酶I和DNaseI浓度（1 mg/mL）、细胞活力阈值（>80%） 阅读提示：Materials and Methods: Isolation of single-cell suspension |
| scRNA-seq文库构建 | 目标细胞数（10,000）、测序参数（read1 150循环、read2 150循环、index 14循环） 阅读提示：Materials and Methods: cDNA library construction and sequencing for scRNA-seq |
| scATAC-seq文库构建 | 目标细胞核数（6,000）、ATAC酶孵育时间（60分钟，37°C）、测序方案（2×50 paired-end） 阅读提示：Materials and Methods: DNA library construction and sequencing for scATAC-seq |
| scRNA-seq数据分析 | 每个细胞基因数≥500、线粒体比例<10%、Harmony批次效应去除、PC数30、聚类分辨率0.5 阅读提示：Materials and Methods: scRNA-seq data analysis |
| scATAC-seq数据分析 | 峰区片段数1000-20000、黑名单比例<0.05、核小体信号<4、TSS富集>1、分辨率0.4 阅读提示：Materials and Methods: scATAC-seq data analysis |
| WES | 测序深度10 Gb、Q30比例>80%、错误率<0.1% 阅读提示：Materials and Methods: WES |
| Bulk ATAC-seq | 细胞数10,000、裂解时间4分钟、转座反应条件（37°C，30分钟）、PCR循环数15 阅读提示：Materials and Methods: Bulk ATAC-seq |
| ASO处理 | ASO浓度和转染时间（48小时） 阅读提示：Materials and Methods: Design and construction of antisense oligonucleotide; Results: scATAC-seq revealed the biological function of lncRNA... |
| 细胞增殖检测 | CCK-8处理时间（48小时）及检测时间点（24, 48, 72小时）；EdU孵育时间（2小时） 阅读提示：Materials and Methods: Cell counting kit-8 and 5-ethynyl-2′-deoxyuridine assay... |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC和PI染色时间（15分钟） 阅读提示：Materials and Methods: Annexin V-FITC/PI and cell-cycle analysis... |
| 迁移和侵袭实验 | 划痕实验细胞数（2×10^4）、Transwell细胞数（6×10^4）、血清浓度（0.1% FBS）、孵育时间（24小时） 阅读提示：Materials and Methods: Wound healing of cell migration and transwell assay |
| 蛋白质印迹 | 细胞数（3×10^6）、抗体稀释度（E-cadherin 1:5000, GAPDH 1:5000, 二抗 1:1000） 阅读提示：Materials and Methods: Immunoblotting |