鉴定间充质样癌细胞的选择性依赖性
识别间充质样癌细胞状态特有的基因依赖性
对约800种实体瘤细胞系进行EMT评分与CRISPR基因必需性评分的相关分析，并利用GSEA富集分析相关通路。
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PKN2是间充质样癌细胞状态的一个依赖性
PKN2 Is a Dependency of the Mesenchymal-like Cancer Cell State
实验完整度
高包含基于约800种细胞系的CRISPR必需性分析、体外克隆形成、体内异种移植瘤模型及定量磷酸化蛋白质组学等多层级验证。
主要模型
间充质样癌细胞系（A375、NCI-H2030、PC3、BT549） 上皮样癌细胞系（22Rv1、HCT-15、MCF7、NCI-H1437） HMLE细胞TGF-β诱导EMT模型 SKMEL28 BRAF抑制剂依赖（BA）模型 PC9、MGH134等EGFR突变NSCLC异种移植瘤模型
重点核对
PKN2基因敲除在不同细胞系中的克隆形成能力 PKN2敲除对Hippo通路下游靶基因表达的影响 PKN2对SAV1 S90位点的磷酸化作用 PKN2敲除对靶向治疗耐药细胞存活的影响 体内异种移植瘤模型中PKN2抑制对肿瘤生长及药物反应的影响
摘要
癌细胞利用间充质样转录状态（MLS）来逃避药物治疗。虽然MLS已被充分表征，但针对该程序的治疗脆弱性很少被识别。在这里，我们通过对约800种癌细胞系中的基因必需性评分进行分析，系统地识别了间充质样癌症的依赖性网络，提名了一个研究较少的激酶PKN2作为MLS的首要治疗靶点。共必需性关系、生化实验和患者肿瘤的基因组分析揭示，PKN2通过PKN2-SAV1-TAZ信号机制促进间充质样癌症的生长。值得注意的是，将遗传性PKN2抑制与针对EGFR、KRAS和BRAF癌基因的临床相关靶向治疗配对，通过消耗间充质样耐药持久细胞来抑制耐药性。这些发现提供了证据表明PKN2是Hippo肿瘤抑制通路的核心调节因子，并强调了PKN2抑制作为一种可推广的治疗策略，以克服由MLS驱动的跨癌症背景的耐药性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 间充质样癌细胞状态的治疗脆弱性是什么？
- 核心机制
- PKN2通过磷酸化SAV1的S90位点抑制Hippo肿瘤抑制通路，从而激活TAZ，促进间充质样癌细胞存活。
- 主要证据
- 基于约800种细胞系的CRISPR必需性分析、共必需性作图、生化实验、定量磷酸化蛋白质组学、体内异种移植瘤模型，以及患者肿瘤数据分析。
- 研究意义
- 该研究将PKN2确定为Hippo通路的核心调节因子，并指出PKN2抑制是一种可推广的治疗策略，以克服由MLS驱动的耐药性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PKN2在间充质样癌细胞中的选择性依赖性
验证PKN2是否特异性地被间充质样癌细胞所需
在多种间充质样和上皮样癌细胞系中进行PKN2敲除的克隆形成实验，并在同源模型中诱导EMT后观察依赖性变化。
绘制共必需性图谱并验证PKN2与Hippo通路的关系
确认PKN2在Hippo通路中的功能
使用共必需性图谱和DepMap预测模型，然后通过RT-qPCR、Western blot和功能实验验证PKN2对YAP/TAZ信号的影响。
验证PKN2通过磷酸化SAV1调控Hippo通路
确定PKN2调控Hippo通路的直接分子机制
通过定量磷酸化蛋白质组学、AlphaFold3预测和体外激酶实验，鉴定并验证PKN2对SAV1 S90的磷酸化作用及其对Hippo信号的影响。
评估PKN2抑制对靶向治疗耐药的影响
确定PKN2抑制是否能克服耐药性
在体外和体内模型中，将PKN2敲除与EGFR、KRAS、BRAF抑制剂联合使用，评估对耐药细胞存活和肿瘤生长的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12 (1:1) 培养基 | Gibco | -- |
| RPMI培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | VWR | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | PLX4720 | Selleck Chemicals | -- |
| 曲美替尼 | Selleck Chemicals | -- | |
| 奥希替尼 | Selleck Chemicals | -- | |
| 阿达格拉西布 | Selleck Chemicals | -- | |
| 强力霉素 | VWR | -- | |
| 4-羟基他莫昔芬 | Medchem | -- | |
| 筛选 | G418硫酸盐 | Gold Biotechnology | -- |
| 杀稻瘟菌素S | Sigma-Aldrich | -- | |
| 动物实验 | 强力霉素盐酸盐 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 他莫昔芬 | MedChem Express | -- | |
| 奥希替尼（泰瑞沙） | AstraZeneca | -- | |
| 克隆 | Q5高保真2X预混液 | New England Biolabs | -- |
| PfuUltra II融合热启动DNA聚合酶 | Agilent | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫沉淀 | 抗HA磁珠 | MedChem Express | -- |
| Western blot | E-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3195 |
| N-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 13116 | |
| AXL抗体 | Cell Signaling Technology | 8661 | |
| 波形蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5741 | |
| HSP90抗体 | Cell Signaling Technology | 4877 | |
| 磷酸化PKN2 (T816)抗体 | Cell Signaling Technology | 2611 | |
| PKN2抗体 | Cell Signaling Technology | 2612 | |
| LATS1抗体 | Cell Signaling Technology | 3477 | |
| 磷酸化LATS1 (Thr1079)抗体 | Cell Signaling Technology | 8654 | |
| 磷酸化YAP (Ser397)抗体 | Cell Signaling Technology | 13619 | |
| 磷酸化YAP (Ser127)抗体 | Cell Signaling Technology | 4911 | |
| YAP/TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 8418 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970L | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| SAV1抗体 | Cell Signaling Technology | 13301 | |
| 磷酸化PKA底物抗体 | Cell Signaling Technology | 9624 | |
| 纽蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 13901 | |
| M2 FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 体外激酶实验 | GST-PKN2重组蛋白 | SignalChem Biotech | P71-10G |
| RT-qPCR | TaqMan探针 TBP | Thermo Fisher Scientific | Hs00427620_m1 |
| TaqMan探针 ANKRD1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00173317_m1 | |
| TaqMan探针 CTGF | Thermo Fisher Scientific | Hs00170014_m1 | |
| TaqMan探针 CYR61 | Thermo Fisher Scientific | Hs00155479_m1 | |
| TaqMan探针 FN1 | Thermo Fisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TaqMan探针 CDH2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00983056_m1 | |
| TaqMan探针 VIM | Thermo Fisher Scientific | Hs00958111_m1 | |
| 细胞活力检测 | Cell Titer Glo试剂 | Promega | -- |
| 流式细胞术 | 死细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V Alexa Fluor 488 & 碘化丙啶） | Invitrogen | V13245 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| eBioscience流式染色缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-57 | |
| 磷酸化蛋白质组学 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| TiO2富集柱 | GL Sciences | -- | |
| EvoSep One超高效液相色谱系统 | EvoSep | -- | |
| Thermo Orbitrap Astral质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养检测 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-318 |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 各细胞系的培养基、血清浓度、培养条件及传代时间 阅读提示：Methods - Cell Culture |
| 药物处理 | 各药物的剂量、处理时间、药物更换频率 阅读提示：Methods - Chemicals；Figure 5、6图例 |
| 基因敲除/敲低 | sgRNA/shRNA序列、诱导方式（如doxycycline、4-OHT）、筛选药物及浓度 阅读提示：Methods - CRISPR/Cas9 knockouts；Figure 1图例 |
| 克隆形成实验 | 细胞接种密度、处理时间、染色方法 阅读提示：Methods - Clonogenic Growth Assay；Figure 1、2图例 |
| 免疫印迹 | 抗体货号、稀释比例、磷酸化位点特异性 阅读提示：Methods - Immunoblotting；Figure 2-3图例 |
| RNA提取与定量 | TaqMan探针货号、管家基因 阅读提示：Methods - RT-qPCR |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度、药物浓度梯度、检测时间 阅读提示：Methods - Short-term cell viability assays；Figure 6图例 |
| 流式细胞术 | 凋亡检测试剂盒、细胞周期染色方法 阅读提示：Methods - Flow cytometry；Figure 5图例 |
| 磷酸化蛋白质组学 | 细胞处理条件、富集方法、质谱参数 阅读提示：Methods - Quantitative Phosphoproteomics |
| 动物实验 | 小鼠品系、年龄、性别、注射细胞数量、药物剂量、给药途径 阅读提示：Methods - In vivo experimentation；Figure 1、6图例 |