鉴定人类供心保存过程中的细胞类型及MR表达
确定冷保存人类心脏中哪些细胞类型表达MR，以及MR表达与细胞功能状态的关系。
对冷保存（4°C）的人类供心（HTK保存）进行单细胞转录组测序，鉴定心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞等，并分析MR在心肌细胞亚群中的差异表达。
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盐皮质激素受体相分离调控心脏保存
Mineralocorticoid receptor phase separation modulates cardiac preservation
实验完整度
高证据层级包括体外蛋白相分离（turbidity、FRAP）、细胞实验、小鼠遗传模型（心肌细胞MR敲除及AAV回补）、离体心脏灌流、猪及人类供体心脏实验，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠离体心脏灌流模型（Langendorff） 小鼠异位心脏移植模型（颈动脉-颈静脉） 猪离体心脏灌流模型 人类供体心脏离体灌流模型
重点核对
MR相分离依赖N端IDR区域，缺失IDR的MRΔIDR不能形成凝聚体且改善心脏功能 canrenone（50μM）添加到HTK保存液中抑制MR相分离并改善供心功能 心肌细胞特异性MR敲除（Myh6CreERT2;MRfl/fl）改善心脏保存质量 人类供心冷保存10小时与CTnI水平及代谢物变化相关
摘要
心脏移植是终末期心力衰竭患者的金标准治疗方法。然而，可用的供体心脏短缺。将供体心脏运送到匹配受者的可耐受短冷缺血时间与这种短缺密切相关。在这里，我们揭示了盐皮质激素受体（MR）相分离的现象，该现象加剧了小鼠和人类供体心脏在冷保存期间的损伤，并且可以通过药理学抑制来调节以改善保存质量。有趣的是，供体心肌细胞强烈表达 MR，MR 经历与保存相关的相分离。大分子相分离现象不仅限于心脏或保存期间的 MR。肺、肝和肾的冷保存也表现出其他转录调节因子的相分离，包括组蛋白去乙酰化酶 1（HDAC1）、含溴结构域蛋白 4（BRD4）和 MR。我们的结果揭示了保存生物学中一个未被充分研究的领域，该领域可能被进一步开发以改善多种实体器官的保存。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 盐皮质激素受体（MR）相分离在供体心脏冷保存损伤中的作用及其能否作为改善保存质量的靶点。
- 核心机制
- 冷保存诱导MR通过其N端内在无序区域（IDR）发生液-液相分离形成核内凝聚体，增强MR转录活性，导致氧化应激和细胞死亡，从而损伤心脏功能；该过程不依赖配体结合。
- 主要证据
- 在人类供心中通过单细胞转录组发现MR在高收缩性心肌细胞亚群高表达；免疫染色显示冷保存后MR形成核内点状凝聚体；体外纯化蛋白和细胞实验确认MR相分离特性；小鼠心肌细胞特异性敲除MR或表达MRΔIDR改善保存后心功能；canrenone抑制MR相分离并改善猪和人类供心功能。
- 研究意义
- 揭示相分离是器官保存生物学中一个未被充分研究的机制，药理学抑制MR相分离可能延长供心保存时间并改善移植结局，且该机制可能广泛适用于其他实体器官保存。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估心肌细胞特异性MR缺失对心脏保存的影响
验证MR在心肌细胞中的功能缺失是否改善冷保存后的心脏功能。
使用他莫昔芬诱导心肌细胞特异性MR敲除小鼠（Myh6CreERT2;MRfl/fl），通过离体心脏灌流和异位心脏移植模型评估心脏收缩和舒张功能，并检测心肌损伤标志物。
验证MR相分离及其分子机制
确定MR在冷保存条件下是否发生液-液相分离，并识别其关键结构域。
通过PONDR预测MR无序区域，体外纯化GFP-MR蛋白进行浊度分析、液滴成像、融合和FRAP实验；细胞实验（NMCM、HEK293）确认核内凝聚体动态；构建缺失IDR的突变体验证其关键作用。
体内回补实验验证MR相分离对心脏保存的影响
在心肌细胞中表达全长MR或缺失IDR的MR，以验证相分离是否介导心脏保存损伤。
使用AAV9向心肌细胞特异性MR敲除小鼠（Myh6CreERT2;MRfl/fl）递送全长MR、MRΔIDR或荧光素酶对照，经历冷保存后离体灌流评估心脏功能及损伤标志物。
评估药理学MR拮抗剂对供心保存质量的影响
测试MR拮抗剂canrenone（及其同类药物）是否能改善冷保存后的心脏功能。
将canrenone（50μM）添加到HTK保存液中，对小鼠、猪和人类供心进行不同时长冷保存，通过离体灌流或移植模型评估心脏功能、损伤标志物及代谢指标。
机制研究：MR基因组结合及代谢改变
阐明canrenone抑制MR相分离后对基因组结合和代谢的影响。
对人类供心进行CUT&RUN测序分析MR结合位点，并进行代谢组学分析，比较HTK±canrenone处理后的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 心脏保存 | HTK保存液 | -- | -- |
| 坎利酮 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胰蛋白酶-EDTA | -- | -- | |
| 胶原酶II | -- | -- | |
| 马血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 腺病毒包装 | Ad-GFP腺病毒 | -- | -- |
| Ad-GFP-MR腺病毒 | -- | -- | |
| 质粒构建 | pET30载体 | -- | -- |
| 蛋白表达 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖 | -- | -- |
| Amicon Ultra离心过滤器 | Sigma | -- | |
| 氯化钠 | -- | -- | |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| 咪唑 | -- | -- | |
| 相分离检测 | 聚乙二醇8000 | -- | -- |
| 甘油 | -- | -- | |
| 浊度测量酶标仪 | Promega GloMax | -- | |
| 显微镜 | Nikon A1共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| BZ-X800显微镜 | Keyence | -- | |
| LSM 980显微镜 | Zeiss | -- | |
| 免疫荧光 | 抗NR3C2抗体 | Sigma | AV45599 |
| 抗8OHdG抗体 | Santa Cruz | sc393871 | |
| 抗HDAC1抗体 | CST | 34589 | |
| 抗Brd4抗体 | Abclonal | A20019 | |
| 抗MR抗体（CST） | CST | 58883S | |
| Alexa Fluor 488/647二抗 | -- | -- | |
| 抗淬灭封片剂 | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| α-微管蛋白抗体 | CST | 3873 | |
| Bcl2抗体 | CST | 3498 | |
| Cleaved Caspase 3抗体 | Abclonal | A2156 | |
| 磷酸化JNK抗体 | CST | 9251 | |
| 总JNK抗体 | CST | 9252 | |
| 磷酸化Erk1/2抗体 | CST | 4370 | |
| 总Erk1/2抗体 | CST | 4696 | |
| IRDye 680RD驴抗小鼠IgG | LI-COR | 926-68072 | |
| IRDye 800CW驴抗兔IgG | LI-COR | 926-32213 | |
| 过氧化物酶标记驴抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | |
| 过氧化物酶标记驴抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-035-152 | |
| AAV包装 | AAV9质粒 | Addgene | 86558 |
| 他莫昔芬 | -- | -- | |
| 肝素 | -- | -- | |
| 离体灌流 | Langendorff装置 | ADInstruments | -- |
| Radnoti灌流装置 | ADInstruments | -- | |
| Krebs-Henseleit缓冲液 | -- | -- | |
| Miller电导导管 | -- | -- | |
| 试剂盒 | MILLIPLEX试剂盒 | Sigma-Aldrich | MCYTMAG, MCVD2MAG, HCVD1MAG |
| 渗透压测量 | Precision Systems Touch Micro-Osmette渗透压计 | Precision Systems | Model 6002 |
| 细胞转染 | Lipofectamine转染试剂 | -- | -- |
| 细胞培养 | 山梨醇 | -- | -- |
| 保存 | Perfadex保存液 | -- | -- |
| CUT&RUN | Epicypher CUT&RUN试剂盒 | Epicypher | 14-1048 |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | NEB | E7103 | |
| 测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 代谢组学 | Acuity超高效液相色谱系统 | Waters | -- |
| MaXis II四极杆飞行时间质谱仪 | Bruker | -- | |
| ACUITY UPLC HSS T3色谱柱 | Waters | -- | |
| ACUITY UPLC BEH Amide色谱柱 | Waters | -- | |
| 统计分析 | Prism 10.0统计软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型建立 | 心肌细胞特异性MR敲除小鼠（Myh6CreERT2;MRfl/fl）的构建及他莫昔芬诱导条件（剂量、时间）。 阅读提示：Methods: Murine ex-vivo heart perfusion |
| 冷保存条件 | HTK保存液成分、冷保存温度（4°C）、保存时间（小鼠16小时，猪4/10小时，人类10小时）。 阅读提示：Methods: Procurement and preparation; Murine ex-vivo heart perfusion; Porcine and human ex-vivo heart perfusion |
| 药物处理 | canrenone浓度（50μM）、是否加入HTK保存液、对照组设置（vehicle）。 阅读提示：Methods: Procurement and preparation; Results: Drug inhibition of MR improves donor heart function |
| 相分离检测 | 体外蛋白浓度（如16μM）、PEG8000浓度（10%）、FRAP参数（激光强度40%、采集时间60秒）。 阅读提示：Methods: Turbidity Measurements; In vitro droplet imaging and FRAP |
| 离体灌流功能评估 | 灌注液（Krebs-Henseleit缓冲液）、灌注时间（1小时）、左室舒张末压设定（~8mmHg）、测量参数（max dP/dt, min dP/dt）。 阅读提示：Methods: Murine ex-vivo heart perfusion; Porcine and human ex-vivo heart perfusion |
| 移植模型 | 供体心脏冷保存时间（16小时）、受体小鼠品系（C57BL/6J）、移植后测量时间（24小时）、血流动力学测量方法。 阅读提示：Methods: Murine heterotopic heart transplantation |
| 分子检测 | 抗体：MR（Sigma AV45599或CST 58883S）、8-OHdG（Santa Cruz sc393871）、HDAC1（CST 34589）、Brd4（Abclonal A20019）；Western blot抗体：α-tubulin、Cleaved Caspase 3等。 阅读提示：Methods: Fluorescence immunohistochemistry; Western blotting |