小RNA测序与靶基因鉴定
鉴定UC患者结肠中差异表达的miRNA及其靶基因，探索CADM1作为miR-375靶点的临床相关性。
对UC患者（n=43）炎症与非炎症结肠组织和NIBD患者（n=16）结肠组织进行小RNA测序，分析miRNA表达谱；结合后续RNA-seq验证CADM1表达与miR-375相关性。
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髓系细胞粘附分子1（CADM1）促进人炎症性肠病中的促炎信号传导
Myeloid Cell Adhesion Molecule 1 (CADM1) Promotes Proinflammatory Signaling in Human Inflammatory Bowel Diseases
实验完整度
高研究包含人结肠组织小RNA/RNA-seq、空间转录组/蛋白质组、原代细胞功能实验、髓系条件敲除小鼠及抗体干预等多个独立证据层级，并进行了功能与机制验证。
主要模型
溃疡性结肠炎患者结肠组织 LysM(Cre/+)Cadm1(fl/fl)条件敲除小鼠 DSS诱导结肠炎小鼠模型 TNBS诱导结肠炎小鼠模型
重点核对
溃疡性结肠炎患者与NIBD对照的结肠组织和血清样本 LysM(Cre/+)Cadm1(fl/fl)小鼠及同窝对照Cadm1(+/+)小鼠 DSS（2.5% 饮用水，8天）和TNBS（3.5% 直肠内给药）诱导结肠炎 抗Cadm1单克隆抗体（clone 9D2）腹腔注射，1 μg/g体重 重组sCADM1处理人LPMCs，检测STAT3 Y705磷酸化
摘要
背景与目的：细胞毒性T细胞被认为可能促进炎症性肠病（IBD）中肠上皮的破坏。与非IBD（NIBD）患者相比，IBD患者结肠中编码可与T细胞受体CRTAM结合的膜粘附蛋白的CADM1显著上调。方法：我们对IBD和NIBD对照患者的结肠组织进行了全面的小RNA和RNA分析，并表征了从这些患者分离的固有层单个核细胞中血清裂解的CADM1胞外域（sCADM1）的功能。最后，开发了一种条件性功能缺失小鼠，以评估化学诱导结肠炎期间髓系区室中Cadm1的功能。结果：我们确定了IBD患者结肠中多个免疫细胞簇（包括巨噬细胞和树突状细胞）中CADM1的富集。与NIBD患者相比，溃疡性结肠炎患者结肠中CD8+ T细胞邻近的CADM1+髓系细胞数量增加。髓系细胞中Cadm1的条件性缺失导致活化T细胞群数量减少，并保护小鼠免受化学诱导的结肠炎。同样，给予结合其胞外域的Cadm1“中和”抗体，在诱导小鼠结肠炎后减少了组织炎症以及肠上皮和隐窝的破坏。最后，与NIBD对照组相比，IBD患者血清sCADM1水平升高，重组sCADM1处理固有层单个核细胞可增强炎症性STAT3磷酸化。结论：CADM1是结肠促炎信号级联的介质，也是IBD的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CADM1在炎症性肠病的肠道炎症中是否发挥作用以及其潜在机制。
- 核心机制
- 髓系细胞上的CADM1与CD8+ T细胞上的CRTAM受体相互作用，促进T细胞活化和细胞毒性，从而驱动肠道炎症和上皮损伤；可溶性sCADM1通过增强STAT3磷酸化促进促炎信号。
- 主要证据
- 人结肠组织分析显示CADM1在髓系细胞中高表达并与CD8+ T细胞邻近；髓系特异性Cadm1敲除或抗体阻断可减轻小鼠结肠炎；rsCADM1处理人LPMCs增强STAT3磷酸化。
- 研究意义
- CADM1是IBD的潜在治疗靶点，血清sCADM1可能作为识别活动性肠道炎症的生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
空间表型与转录组分析
研究CADM1在IBD结肠组织中的细胞定位及免疫细胞空间关系。
使用MIBI-ToF对UC患者配对炎症/非炎症组织进行多重蛋白成像；使用nanoString GeoMx平台进行空间转录组和蛋白组分析；使用公开单细胞RNA-seq数据集分析CADM1和CRTAM表达。
免疫组化验证细胞邻近性
验证UC患者结肠组织中CADM1+髓系细胞与CD8+ T细胞的邻近关系。
对UC（n=4）和NIBD（n=4）患者结肠组织进行免疫染色，定量CADM1+CD11c+细胞和邻近CD8+ T细胞的数量及CADM1表达强度。
髓系特异性Cadm1敲除小鼠DSS结肠炎模型
评估髓系细胞Cadm1缺失对DSS诱导结肠炎的抑制作用及其对T细胞活化的影响。
利用LysM(Cre/+)Cadm1(fl/fl)小鼠及同窝对照，给予2.5% DSS饮水8天诱导结肠炎，评估DAI评分、结肠长度、组织学损伤及T细胞活化标志。
抗Cadm1抗体治疗TNBS结肠炎模型
验证抗Cadm1单克隆抗体对TNBS诱导结肠炎的保护作用。
C57BL/6J小鼠在TNBS处理期间接受抗Cadm1 mAb或PBS腹腔注射，评估DAI评分、体重变化、结肠长度和组织学损伤。
血清sCADM1水平检测
检测IBD患者血清sCADM1水平是否升高。
通过ELISA检测UC和CD患者及NIBD对照血清sCADM1浓度。
重组sCADM1处理人LPMCs
验证sCADM1是否促进人结肠LPMCs的STAT3磷酸化和炎症反应。
分离UC和NIBD患者结肠LPMCs，用rsCADM1单独或联合IL-6处理，Western blot检测STAT3磷酸化和IL-1β水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA-seq | TRIzol | 文中未明确说明 | -- |
| 总RNA纯化试剂盒 | Norgen Biotek | -- | |
| 小RNA测序 | TruSeq小RNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| 小鼠模型 | DSS（结肠炎级） | MP Biomedicals | 160110 |
| 抗体治疗 | 抗CADM1单克隆抗体（克隆9D2） | MBL | CM005-3 |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| 抗CADM1抗体 | MBL | CM004 | |
| 抗IL-1β抗体 | Proteintech | 26048-1-AP | |
| 抗Actin抗体 | Proteintech | 60008-1 | |
| 抗pSTAT3 (Tyr705)抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| 抗STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9139 | |
| 抗兔IgG-HRP | Genesee Scientific | 20-303 | |
| 抗鼠IgG-HRP | Genesee Scientific | 20-304 | |
| 抗鸡IgY-HRP | Thermo Fisher Scientific | A16054 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | 1705061 | |
| 免疫组化 | 抗CD8 alpha抗体（克隆C8/144B） | Thermo Fisher Scientific | MA5-13473 |
| 抗CADM1抗体 | MBL | CM004-3 | |
| 抗CD11c抗体 | Proteintech | 17342-1-AP | |
| 抗兔IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21244 | |
| 抗鸡IgY Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11042 | |
| 抗鼠IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11029 | |
| 含DAPI的Fluoroshield封片剂 | Sigma Aldrich | F6057 | |
| 流式细胞术 | 红细胞裂解液 | BioLegend | -- |
| LIVE/DEAD可固定近红外死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗CD45抗体 | BioLegend | 103155 | |
| 抗CD3抗体 | BioLegend | 100306 | |
| 抗CD4抗体 | BioLegend | 10557 | |
| 抗CD8抗体 | BioLegend | 100734 | |
| 抗NK1.1抗体 | BioLegend | 108706 | |
| 抗CD25抗体 | BioLegend | 102037 | |
| 抗TCR-β抗体 | BioLegend | 109211 | |
| Cyto-Fast固定/通透缓冲液套装 | BioLegend | -- | |
| 抗IFN-γ抗体 | BioLegend | 505810 | |
| 抗TNF-α抗体 | BioLegend | 506305 | |
| 抗颗粒酶B抗体 | BioLegend | 515408 | |
| 细胞培养 | TexMACS培养基 | Miltenyi Biotech | 130-097-196 |
| 白细胞介素-6 | BD Biosciences | 550071 | |
| T细胞活化/扩增试剂盒 | Miltenyi Biotech | 130-093-627 | |
| ELISA | 抗CADM1抗体（克隆9D2） | MBL | CM005-3 |
| VECTASTAIN ABC-AP试剂盒 | Vector Laboratories | AK-5000 | |
| CSPD化学发光底物 | Applied Biosystems | T2212 | |
| ISH | miRNAscope HD检测试剂RED | ACDBio | 324510 |
| 探针SR-hsa-miR-375-3p-S1 | ACDBio | 728581-S1 | |
| 仪器 | NovaSeq | Illumina | -- |
| HiSeq 2500 | Illumina | -- | |
| MIBIscope | IonPath | -- | |
| ECLIPSE Ti2倒置共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| CytoFLEX LX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| BioTek Cytation 5微孔板读数仪 | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小RNA测序样本 | 患者队列：UC(n=43)和NIBD(n=16)；组织类型：炎症和非炎症；RNA完整度：4.9-8.3 阅读提示：Table 1及Materials and Methods 'Small RNA Isolation, Sequencing, and Processing' |
| DSS诱导结肠炎小鼠模型 | 小鼠基因型：LysM(Cre/+)Cadm1(fl/fl)与Cadm1(+/+)，雄性，10周龄；DSS浓度：2.5% 饮用水；处理时间：8天；样本量：n=5/组；3次独立重复 阅读提示：Figure 5及Materials and Methods 'Animals' |
| TNBS结肠炎模型及抗体干预 | 小鼠品系：C57BL/6J雄性；抗体：抗Cadm1 mAb (clone 9D2) 1 μg/g体重腹腔注射，第0-6天；TNBS：3.5% 100 μL直肠内给药；样本量：n=5/组 阅读提示：Figure 6及Materials and Methods 'Hapten-Mediated Colitis Induction With TNBS' |
| LPMC功能实验 | 细胞来源：UC和NIBD患者结肠LPMCs；rsCADM1浓度：1 mg/mL；预处理时间：30分钟；IL-6浓度：2 ng/mL；刺激时间：15分钟 阅读提示：Materials and Methods 'LPMC Isolation, Treatment, and Processing'及Figure 8 |
| 血清sCADM1检测 | 患者组：UC(n=33)、CD(n=17)、NIBD(n=20-23)；检测方法：ELISA 阅读提示：Materials and Methods 'CADM1 ELISA'及Figure 7 |